МД-2021, день 1. Методы молекулярного анализа в диагностике и эпидемиологии туберкулезной инфекции

Секцию открыл Мигель Вивейрос (Universidade NOVA de Lisboa) с докладом о лабораторной диагностике туберкулеза (ТБ).

За 2020 год от туберкулеза скончалось 1,5 млн. человек, включая 214 тыс. ВИЧ-положительных больных, и сильно снизилось количество выявленных случаев ТБ из-за пандемии COVID-19. Основными проблемами в терапии ТБ являются одновременное присутствие ТБ и ВИЧ-инфекции, а также множественная лекарственная устойчивость у ТБ (МЛУ ТБ), то есть устойчивость к рифампицину и изониазиду, и широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ ТБ). Вивейрос отметил важность развития новых методов диагностики и терапии и разработки новых вакцин против ТБ.

Идентификацию M. tuberculosis впервые провели в 1989 году при помощи микроскопа. С тех пор методы диагностики ТБ значительно усовершенствовались. Сегодня возможно выявить МЛУ и ШЛУ ТБ в течение 1 ч 25 минут при помощи гибридизации с ДНК-зондами. С развитием молекулярных методов в Лиссабоне снизилась доля случаев МЛУ ТБ с 35% в 2000 до <0,5% в 2020 и ШЛУ ТБ с 75% в 2011 до 0% в 2020.

С 2013 года применяется полногеномное секвенирование. Его внедрение позволило сократить передачу, проконтролировать распространение и возникновение устойчивости ТБ к антибиотикам. Данный метод имеет ряд недостатков, в том числе высокую стоимость и возможность перегрузки матрицы, но, как отмечает Вивейрос, за полногеномным секвенированием стоит будущее.

В следующем докладе Паоло Миотто (Ospedale San Raffaele) рассказал о секвенировании нового поколения (NGS) и диагностике ТБ с ЛУ. NGS открывает новые возможности поиска мутаций, ответственных за антибиотикорезистентность. Это крайне важно при выборе терапии. Существует два основных направления NGS: направленное, или таргентное, секвенирование и полногеномные секвенирование.

В рамках программы Seq&Treat были собраны данные о мутациях, приводящих к антибиотикорезистентности ТБ в более чем 40 странах. При сравнении фенотипических тестов на эффективность препаратов с результатами секвенирования выявили хорошее совпадение результатов. При этом NGS — более объективный и точный метод поиска мутаций. В дальнейшем планируется пополнения каталога мутаций.

Следующий спикер, Дарья Старкова (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера), рассказала о результатах полногеномного секвенирования российских клинических изолятов Mycobacterium bovis BCG-1.

ВОЗ считает БЦЖ единственной лицензированной вакциной против туберкулеза. По сравнению с другими вакцинами она отличается своей безопасностью. Тем не менее, вакцинация БЦЖ может привести к различным осложнениям, в крайнем случае — БЦЖ-инфекции. Чаще всего она возникают у детей до пяти лет, но может развиться и у подростков.

В своем исследовании группа Старковой применила метод полногеномного секвенирования для сравнительного анализа последовательностей ПС (посевных серий) 361 «ш» и 368 «щ» BCG-1 и дочерних изолятов, полученных от детей с БЦЖ-оститами. ПС 387 «щ» используется в России для производства вакцины в настоящее время, ПС 361 «ш» использовалась с 2002 по 2007 гг.

Оба ПС генетически полиморфны по нескольким генам, при этом 361 «ш» оказалась более гетерогенной. Полиморфизмы не нарушают стабильность генома и жизнеспособность вакцины при длительном существовании в организме пациента (до 14 лет). Старкова указала на важность дальнейших исследований геномных вариаций в изолятах БЦЖ при развитии БЦЖ-оститов и других осложнений.

После Дарьи Старковой выступила Анна Панова (НМИЦ фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний). Она рассказала о роли NGS в диагностике лекарственно-устойчивого туберкулеза. При сравнении с фенотипическими методами, NGS имеет ряд преимуществ: значительно меньшее время до получения результатов (3–4 дня на запуск), большую пропускную способность, высокую специфичность и чувствительность, а также меньшую стоимость в пересчете на образец.

Панова рассказала об исследовании ЛУ 47 изолятов M. Tuberculosis, отобранных случайным образом из коллекции НМИЦ ФПИ. При помощи NGS и фенотипического метода научная группа получила данные о высокой чувствительности изолятов к фторхинолону, офлоксацину, левофлоксацину и другим препаратам. Был также проведен поиск маркеров адаптационного процесса бактерий; планируется дальнейшее исследование. Панова отметила, что технология NGS может служить ценным инструментом для надзора за лекарственно-устойчивым туберкулезом.

Следующий спикер, Данила Зименков (ИМБ им. В.А. Энгельгардта), представил доклад о математическом моделировании для предсказания устойчивости M. tuberculosis и оценке резистентности на основе данных полногеномного секвенирования. Зименков рассказал о модели, которая применяется в его лаборатории для предсказания антибиотикорезистентности. Детерминанты резистентности выявляются после обработки результатов полногеномного секвенирования, доступных в базах данных.

В настоящий момент ведутся исследования с применением методов таргетного и полногеномного секвенирования по оценке резистентности к этионамиду. К этионамиду чувствительны 50% исследованных штаммов МЛУ и пре-ШЛУ ТБ, а также 30% ШЛУ ТБ. Зименков указал на значимость этионамида, так как на данный момент крайне мало антибиотиков, к которым чувствительны штаммы ШЛУ ТБ.

Доклад Елены Мазуриной (Уральский НИИ фтизиопульмонологии) был посвящен особенностям тестирования на ЛУ M. tuberculosis к рифампицину. Существует проблема расхождения результатов при определении чувствительности/устойчивости M. tuberculosis к рифампицину разными методами. Остается актуальным вопрос о комплексной оценке их использования и клинической интерпретации результатов.

Целью исследования, описанного Мазуриной, было сравнение фенотипических и молекулярно-генетических методов при проверке чувствительности изолятов M. tuberculosis, выделенных из клинического материала. Авторы использовали ПЦР с последующим определением спектра мутаций системой «ТБ-ТЕСТ» («БИОЧИП-ИМБ») и другие методы определения лекарственной чувствительности.

Мазурина обращает внимание, что при использовании «ТБ-ТЕСТ», «Амплитуб-МЛУ-РВ», системы BACTEC MGIT 960 и метода абсолютных концентраций нужно с осторожностью интерпретировать результаты при определении устойчивости к рифампицину и другим препаратам. Более достоверные результаты получили при использовании метода, основанного на определении минимальной ингибирующей концентрации в ходе серийных разведений. Различия в полученных результатах указывают на необходимость дальнейшего изучения резистентности к рифампицину и поиску консенсуса об оптимальных методах ее оценки.

Олег Огарков (Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека) рассказал о метагеномном анализе бактериального сообщества некротического содержимого туберкулом. В связи с тем, что в настоящее время туберкулезные очаги оперируют только в России и Корее, у отечественных ученых есть уникальная возможность изучать их состав. Огарков задался вопросом, образуются ли биопленки M. tuberculosis in vivo и могут ли формироваться полимикробные сообщества. При моделировании такой биопленки бактерии M. tuberculosis оказываются защищенными от воздействия антибиотиков вплоть до 1 000-кратных доз. Если подобные биопленки могут образовываться в организме, это может значительно влиять на ход лечения.

In vitro M. tuberculosis образовывала биопленки с бактериями рода Bacillus, выделенными из мокроты. Тем не менее, при дальнейшем исследовании не нашли значимого количества Bacillus в некротическом материале туберкулом. Секвенирование (по Сенгеру и NGS) выявило в некоторых образцах туберкулом значительное количество стафилококков (80%), но в большинстве образцов их доля была значительно меньше.

Полногеномное секвенирование, к огромному разочарованию исследователей, показало, что 99% ридов принадлежат Homo sapiens, поэтому был сделан вывод о том, что внутри туберкулом преимущественно находятся остатки клеток, а не полимикробное сообщество. При этом преобладание микобактерий в микробных сообществах было зарегистрировано только в пяти образцах. В других туберкуломах бактериальные профили варьировали.

Огарков осветил результаты исследования американских ученых. Они показали, что при разжижении твердой туберкуломы возникает дефицит цинка. Возможно, при этом начинает активно размножаться сателлитная микробиота, а рост M. tuberculosis замедляется. Основываясь на этих данных и собственных результатах, Огарков предполагает, что полимикробные туберкуломы все-таки могут существовать, но это требует дальнейшего исследования.

Следующий докладчик, Егор Шитиков (ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА), рассказал о микобактериях туберкулеза генотипа Beijing B0. Микобактерии достаточно мономорфны, однако изучение генотипа Beijing B0 показало, что мы воспитали монстра. В геноме Beijing B0 присутствуют инверсии; штаммы этого генотипа устойчивы в среднем к шести антибиотикам.

В России четверть всех изолятов Beijing относятся к кластеру Beijing B0/W148. Они в среднем отличаются друг от друга на 28 полиморфизмов и имеют разнообразные компенсаторные мутации, связанные с устойчивостью, регуляцией и вирулентностью, которые обуславливают высокую степень адаптации. В их число входят мутации в генах системы KdpDE и WhiB6.

После Шитикова выступила Татьяна Умпелова (Уральский НИИ фтизиопульмонологии). Она представила результаты исследования микробиоты легких и кишечника больных туберкулезом методом масс-спектрометрии. Для анализа микробиоты использовали венозную кровь, бронхоальвеолярные смывы, а также образцы операционного материала.

В легких больных туберкулезом было обнаружено увеличение количества бактерий, характерных для кишечной микробиоты (бифидобактерий, пропионобактерий, лактобактерий, эубактерий и актинобактерий). Это соответсвтует теории о транслокации микроорганизмов из кишечника, согласно которой под действием стресса микроорганизмы могут перемещаться в пораженный орган, чтобы создать защитную биопленку. Интересно, что в образцах смывов от двух пациентов доля микобактерий составляла всего 0,2% от всех микроорганизмов.

Информация о докладчиках

Мигель Вивейрос, профессор, Universidade NOVA de Lisboa, Лиссабон, Португалия.

Паоло Миотто, Ph.D., глава отдела новых бактериальных патогенов, Ospedale San Raffaele, Милан, Италия.

Дарья Андреевна Старкова, к.б.н., научный сотрудник лаборатории молекулярной эпидемиологии и эволюционной генетики ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора, Санкт-Петербург.

Анна Евгеньевна Панова, к.м.н., зав. отделением лабораторной диагностики ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний» Минздрава России, Москва.

Данила Вадимович Зименков, к.б.н., ФГБУ «ИМБ им. В.А. Энгельгардта» РАН, Москва.

Елена Александровна Мазурина, Уральский НИИ фтизиопульмонологии — филиал ФГБУ «НМИЦ ФПИ» Минздрава России, Екатеринбург.

Олег Борисович Огарков, д.м.н., г. н. с., заведующий отделом эпидемиологии и микробиологии ГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», Иркутск.

Егор Александрович Шитиков, к.б.н., руководитель лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГБУ ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА России, Москва.

Татьяна Валерьевна Умпелева, к.б.н., Уральский НИИ фтизиопульмонологии — филиал ФГБУ «НМИЦ ФПИ» Минздрава России, Екатеринбург.