МД-2023: Криминалистика

Секцию открыл Владимир Харьков, д.б.н., Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томский НИМЦ РАН (Томск), который прочитал доклад «Проблемы и перспективы ДНК-идентификации и определения этнической принадлежности людей по различным наборам ДНК-маркеров».

Генотипирование образцов ДНК в настоящее время является достаточно доказательным методом анализа биологического материала при производстве судебно-медицинской экспертизы. Докладчик подчеркнул важность биочиповых данных и полногеномного секвенирования для определения этнической принадлежности человека. Короткие тандемные повторы быстро мутируют, и у них нет специфических различий между популяциями по частотам аллелей.

Уже более 20 лет институт проводит исследования популяционной генетики различных народов. С 2001 года докладчик занимается сбором биологического материала в рамках экспедиций.

Были показаны значительные различия по частотам разных SNP, и это имеет большое значение для разработки идентификационных наборов. Это важно не только для STR-локусов, но и для аутосомных чипов и Y-хромосомных SNP.

Институт уже много лет сотрудничает с МВД и следственным комитетом. Вместе с компанией «ГОРДИЗ» разрабатываются новые более точные наборы для ДНК-идентификации и замены импортных наборов.

Новые исследования повышают точность идентификации личности. Это важно не только для определения родственных взаимосвязей при анализе останков или следов преступника. Можно узнать принадлежность не только к народу, но и к субэтнической группе. А по маркерам на Y-хромосоме в достаточно изолированной популяции (горного Дагестана, Сибири) человека можно опознать вплоть до родовой фамилии и поселка. В Дагестане генофонд людей, живущих в 2–3 км друг от друга, различается кардинально.

В последние годы проходила программа по ДНК-идентификации совместно с ИОГен РАН. В ее рамках секвенировали много полных геномов, много высокоплотных биочипов. Были показаны точные индивидуальные различия образцов. Например, в Сибири существует четкое разделение по разным национальностям.

Для исследования останков и следов преступника большие высокоплотные чипы не совсем подходят, поскольку концентрация ДНК и ее качество низкие. Нужно из всего объема отобрать отдельные мутации, чтобы работать не с миллионами, а с 10–30 тысячами.

При расчете коэффициента геномного инбридинга было показано, что европейские популяции имеют низкие значении, а в популяции Дагестана и Сибири — высокие. Высокий уровень инбридинга снижает точность определения родства. Это было показано на двух наборах — из 13 и 20 аутосомных STR. Для этого и нужны биочипы с высоким покрытием по X-хромосомам и аутосомам.

SNP-маркеры, найденные с помощью массового параллельного секвенирования, имеют огромный потенциал для использования в этнической идентификации биологических образцов. Также маркеры Y-хромосомы — важное дополнение для аутосомных SNP.

Докладчик добавил, что нужно расширять базу данный, в том числе мигрантов из Средней Азии

Сергей Леонов из ООО «ГОРДИЗ» (Москва) прочитал доклад «Новые разработки в области анализа индивидуализирующих маркеров человека в судебно-медицинской экспертной практике».

Компания более 15 лет разрабатывает наборы для криминалистики и судебной медицины. У нее есть первое в России сертифицированное производство.

В линейку компании входит множество продуктов, в том числе для сбора материала, экспресс-экстракции ДНК, полноценной экстракции экспертных образцов, как автоматизированной, так и ручной.

Компания разработала уникальные технологии нормирующей амплификации ДНК для STR-анализа без этапа нормирования, разведения и определения концентрации ДНК. Неважно, какое количество ДНК попадает в реакцию, на выходе получается один и тот же нормированный сигнал. Это позволяет экономить силы и средства.

На этом принципе основывается система «COrDIS ЭКСПЕРТ 26», она используется в более 200 лабораторий.

Также есть наборы для других целей, таких как идентификация материала по половым хромосомам, анализ митохондриальной ДНК, идентификации биоматериала животных.

Идет разработка порядка 15 проектов. В следующем году планируется релиз тест-системы для типирования Y-хромосомы и возможного определения этнической принадлежности образца.

Большая проблема — это софт. Он, как правило, создан зарубежными компаниями, при этом разрабатывался давно и с тех пор не развивался. Нужно разрабатывать российскую платформу. Она должна быть совместима со всеми платформами и обладать всеми возможностями алгоритмизации. Как подчеркнул докладчик, рутинные задачи должны решать алгоритмы, а не эксперты. Это будет модульная среда, к которой можно будет добавлять новые инструменты.

Владимир Соколов из компании «Оснащение экспертов» (Москва) прочитал доклад «Оснащение молекулярно-генетической лаборатории в современных условиях».

Посте ухода западных компаний, основных поставщиков оборудования и готовых решений в области генетической экспертизы, взник вакуум. Не все могли заместить отечественные производители. Но на данный момент удалось восполнить все этапы.

Компания «Оснащение экспертов» может предложить различное общелабораторное оборудование, в том числе для пробоподготовки, термошейкеры, тесты для определения крови и спермы.

Первый этап — выделение ДНК. Компания может предложить набор от Bioer («MagaBio Forensic Sample DNA Purification Kit»). Он адаптирован для работы с криминалистическими образцами, от цельной крови до сложных объектов (жвачка, листва, почва, кости, зубы). Есть наборы для ручного выделения и автоматизированные решения, также колоночные решения.

Следующий этап — определение концентрации ДНК. Предлагается прибор «Quantgen 9600». Он валидирован для работы с наборами для real time от «Синтол». Для этапа амплификации предлагается прибор «GeneExplorer».

Также в наличии есть STR-наборы, такие как «Panglobal Plus» — базовый набор. Предлагает 25 аутосомных локусов, 12 из которых находятся в «короткой зоне» — до 220 п.о., для работы с деградированными образцами. Есть набор с дополнительными локусами.

Генетические анализаторы представлены в вариантах G08, G16, G24 в зависимости от количества капилляров. Приборы приводятся из Китая и уже работают в нескольких лабораториях.

Компания тестирует все продукты перед тем, как предложить их клиентам. Также предлагается комплексное оснащение лаборатории, установка приборов и обучение.

Дмитрий Рудик из компании «БиоХиммак» выступил с докладом «Разработка отечественной автоматической станции выделения нуклеиновых кислот для судебной медицины, медицинской генетики и диагностических ПЦР-лабораторий». Компания занимается молекулярной диагностикой. Докладчик подчеркнул преимущества автоматизированного выделения нуклеиновых кислот и рассказал о работе автоматической станции «GeneMack Strela».

Программное обеспечение станции на русском языке. Выделение нуклеиновых кислот занимает 16–35 минут в зависимости от протокола. Характеристики аналогичны ведущему импортному оборудованию. Техподдержка доступна 24/7. Реагенты находятся в индивидуальных картриджах, полная автоматизация. Возможна одновременная экстракция 13 образцов. Широкий спектр объектов, из которых можно выделять НК. При сравнении со станцией Thermo Fisher получили воспроизводимые результаты, станция прошла апробацию.

Дмитрий Романюк из АНО «Институт синтетической биологии» (Москва) выступил с докладом «Наборы для идентификации человека, взгляд разработчика»

При разработке наборов для идентификации все хотят получить больше локусов, как этого достичь?

У каждого фрагмента на форезе есть два показателя — размер и условный цвет. Нужно 5+1 флуорофоров — 5 для каналов для STR, шестой — для размерного стандарта

У современных приборов есть один источник возбуждения. У краски широкий фронт испускания, за счет чего получается засветка соседних каналов детекции. В итоге финальный сигнал в каждом канале слабее. В реальности теряется до 99% сигнала.

Чтобы получить больше каналов, нужно покупать новое оборудование.

Артём Никулин из компании «Синтол» (Москва) прочитал доклад «Отечественные молекулярно-генетические решения для криминалистики и судебно-медицинской экспертизы».

Компания «Синтол» работает на рынке биотехнологий с 1997 года. Она предлагает решения не только в сфере криминалистики, но и, например, в сфере ветеринарии и растениеводства. Миссия компании — находить не просто решения, а комплексный подход, чтобы эксперт в конечном счете получил качественный результат.

«Синтол» занимается синтезом олигонуклеотидов. Компания разрабатывает и производит наборы, в том числе предназначенные для идентификации мясной и рыбной продукции, фитопатогенов, инфекционных заболеваний, туберкулеза, ГМО, анализа ДНК в криминалистике. Также в сотрудничестве с другими компаниями (Консорциумом «Российские генетические технологии») «Синтол» занимается разработкой и производством оборудования.

Процесс идентификации личности можно разделить на следующие этапы: выделение ДНК, оценка ее качества и количества, амплификация STR-маркеров и (если возможно) секвенирование митохондриальной ДНК, загрузка образцов в прибор, капиллярный электрофорез и анализ данных.

Никогда не знаешь, из чего потребуется выделить НК. Это может быть просто кровь, трупная кровь, пот, сперма, волосы, зубы и кости — все, что нашли на месте преступления. Хотелось бы иметь универсальный набор, который подходил бы для всех объектов.

Для выделения ДНК из простых образцов «Синтол» предлагает набор «ГенПреп», а для более сложных объектов — набор «М-Сорб», основанный на принципе магнитной сорбции.

Есть и отечественное решения для автоматического выделения — станция «Colibri» на 96 и 48 образцов. Позволяет выделять ДНК совместно из различных образцов, таких как цельная кровь, ногти, волосы, буккальный эпителий с сигаретного фильтра, жевательной резинки, контактные линзы. Протокол выделения из 96 образцов занимает 25 минут.

Следующий этап — оценка качества и количества ДНК.

Компания «Синтол» давно выпускает наборы для определения концентрации ДНК человека. Первым набором был «А-детект», который определял только концентрацию ДНК и наличие ингибиторов. Второй набор — «XY-детект» — может еще определять наличие Y-хромосомы. Третий набор определяет также степень деградации ДНК — «RealQuant H3». В наборе есть четыре мишени — на Y-хромосому, две мишени на аутосомы (большой и маленький фрагменты), а также IPC — внутренний положительный контроль, который помогает определить, работает ли система. Докладчик показал калибровочные и амплификационные кривые.

Набор высокоспецифичен к ДНК человека при сравнении с ДНК животных.

Амплификатор производства «Синтол» — АНК 32 — обладает возможностью построения внутренней калибровочной кривой для одной серии наборов. То есть можно однажды поставить стандартные калибровочные образцы, получить кривые и в дальнейшем уже их не ставить, что экономит реагенты.

Для STR-амплификации у компании также есть своя разработка — «GeneProfile Human» на 25 аутосомных и три половых локуса. Используются шесть красителей. Докладчик показал аллельную лестницу. При создании набора была проведена большая работа, чтобы правильно выстроить локусы.

Компания предлагает набор «GenSeq» для секвенирования мтДНК по методу Сэнгера. Это единственное отечественное решение для этой задачи.

Докладчик выделил этап загрузка образца в прибор отдельно. Дело в том, что при подготовке смеси немаловажную роль играет формамид. Компания производит высокоочищенный Di-Fa формамид, а также пластик, такой как пробирки типа «Эппендорф», антииспарители и 96-луночные планшеты.

Компания разработала прибор для капиллярного электрофореза — «Нанофор 05». Этот генетический анализатор позволяет разделять одноцепочечные молекулы ДНК разной длины с разрешением в один нуклеотид. Прибор очень устойчив к перегрузам, при этом чувствителен к малым количествам ДНК. Есть сервис и поддержка напрямую от производителя. Он апробирован ЭКЦ МВД РФ, СК РФ и Комитетом судебных экспертиз Республики Беларусь. Компания предлагает все расходники для «Нанофор 05», а также отдельный компьютер с программным обеспечением для анализа данных.

«Синтол» проводит научные тренинги и школы, пишет обучающие программы и методические материалы.

 Credit: Денис Зыбин

Анастасия Сапун из компании «Альгимед Техно» (Москва) прочитала доклад «Новые возможности контроля ДНК(РНК)-контаминации в ПЦР-лабораториях, меры и способы ее выявления/устранения».

ДНК- и РНК-контаминации встречаются не только в криминалистических лабораториях, но и в клинических, связанных с пищевой безопасностью и ветеринарией. Особенно остро вопрос контаминации стоял в период пандемии.

Какие типы контаминации существуют? Для криминалистов особое значение имеет геномная ДНК человека. Для клинических, ветеринарных и пищевых лабораторий — РНК, плазмидная ДНК, вирусная РНК и ДНК, кДНК и продукты амплификации при ПЦР.

Последствия контаминации для лаборатории: выдача неверных результатов, потеря реагентов и материалов, задержка выдачи результатов, потеря времени и сил персонала.

Причины контаминации: большие потоки, накопление в лаборатории образцов, неразумная утилизация отходов и накопление отходов в лаборатории, перекрестная контаминация на этапе дозирования, технические ошибки при проведении манипуляций, чаще всего на этапе выделения (как наиболее трудоемком), отсутствие регулярного внутрилабораторного контроля качества работы, прописанных процедур и порядка работы. Загрязнение рабочей зоны ампликонами происходит при вскрытии пробирки (планшета) в амплификаторе (в том числе при неправильном подборе пластика к амплификатору).

Признаки контаминации: положительный сигнал в отрицательных образцах, резкое увеличение доли положительных проб, невалидные контрольные образцы и стандарты (калибраторы)

Компания захотела создать универсальное решение для внутрилабораторного контроля.

При этом хотелось бы, чтобы не было необходимости выделять РНК и ДНК, можно было выявить тип и место локализации контаминации, у набора была высокая чувствительность. Также компания проводит техническое обслуживание термоциклеров и нужен был набор для того, чтобы сервисный инженер мог бы показать, что прибор чист после обслуживания. Также нужна была стандартизованная процедура внутрилабораторного контроля.

В результате был разработан набор «Clean Check DNA-RNA Free».

Набор выявляет от 10 копий геномной человеческой ДНК в испытуемом образце. Он работает на различных образцах.

Компания рекомендует регулярно проверять восемь мест в лаборатории.

Оператор работает 10 мин, результаты можно получить через три часа. Набор расходуется экономно. Срок годности 12 месяцев. Не требуется покупка дополнительного оборудования.

Компания пользуется проверенными решениями для деконтаминации.