«Метафаза» рассказала об индуцированных плюрипотентных стволовых клетках

В области биомедицинских исследований у ИПСК огромные возможности. Что касается клинического применения, все оказалось не так просто.

Эрдэм Дашинимаев, представляющий Центр высокоточного редактирования генома и генетических технологий для биомедицины РНИМУ им. Н.И.Пирогова, и сам работает с ИПСК. Репрограммирование клеток — одно из направлений исследований в двух его лабораториях — в РНИМУ и в Российском университете дружбы народов им. Патриса Лумумбы.

Стволовые клетки называются так, поскольку находятся в стволе дерева, в виде которого можно представить развитие около 300 типов различных клеток из одной клетки — зиготы. Все они несут один и тот же геном, но выполняют заложенные в нем разные программы. Задача репрограммирования — эти программы менять. По потенциалу дифференцировки в разные специализированные клетки стволовые клетки делятся на несколько типов. Тотипотентностью — возможностью порождать все клетки организма обладает только зигота; плюрипотентные — это эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и ИПСК; мультипотентные — мезенхимальные, гемопоэтические, нейральные и прочие стволовые клетки в различных тканях, наконец, унипотентные — это клетки-предшественники различных клеточных типов.

Технологию получения ЭСК человека разработал в 1998 году Джеймс Томсон (с ЭСК мыши ученые работали уже лет 20 до этого). Поскольку все понимали регенеративные возможности ЭСК, это достижение вызвало всплеск оптимизма в научной среде. Уже появилась технология переноса ядра и нарисовалась заманчивая перспектива: взять клетки у пациента, пересадить ядро в человеческие ЭСК, и получить пациент-специфические ЭСК, которые можно использовать для терапии любых тканей и органов. Но для работы с ЭСК человека нужно разрушить эмбрион, и на пути развития технологии встал этический барьер. В США был введен запрет на финансирование работ с ЭСК.

Потом появилась альтернатива — получение плюпотентных клеток из специализированных клеток путем репрограммирования. Технологию получения ИПСК создал в 2006 году Синъя Яманака, за что в 2012 году получил Нобелевскую премию. К этому времени ученые выяснили, какие гены наиболее активно работают в стволовых клетках, но казалось, что репрограммировать их все невозможно. Яманака взял 24 гена, ввел их в конструкцию с лентивирусом, заразил этим вектором фибробласты мыши и получил плюрипотентные клетки. А затем перебирал по одному все 24 гена, чтобы найти ключевые факторы, «мастер-гены», управляющие активностью других генов. Таким образом были найдены четыре гена, которые впоследствии стали называть «коктейлем Яманаки»: Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc.

Для трансфекции их в клетку можно использовать вирусный вектор, мРНК или плазмиду. Сейчас эта процедура не представляет технической сложности — можно заказать специальный набор для репрограммирования и использовать его. А когда появилась технология CRISPR, выяснилось, что с ее помощью можно также репрограммировать клетки, без трансфекции, путем запуска собственных плюрипотентных генов клетки.

Теоретически можно репрограммировать любые клетки — но с разной эффективностью (и есть способы ее увеличить). Согласно схеме, которую представил Эрдэм Баирович, на репрограммирование и выращивание клонов ИПСК уходит около месяца.

Но свойства полученных клеток надо доказать. Для этого их окрашивают на маркеры плюрипотентности, проводят количественную ПЦР на уровень экспрессии генов-маркеров. Еще есть тест на образование эмбриоидных телец — клетки образуют трехмерное подобие эмбрионов с маркерами трех зародышевых листков. Наконец, проводят тест на образование тератом — злокачественных опухолей при имплантации клеток иммунодефицитным мышам.

Лектор подчеркнул, что применение ИПСК в исследованиях снимает этические проблемы, связанные с ЭСК. Например, в получении «трудных» культур — клеток нервной ткани, печени и др, которые нельзя взять у человека так же легко, как кровь или фибробласты кожи. С из помощью можно моделировать наследственные заболевания. Схема такая: взять у больного фибробласты, получить из них ИПСК, дифференцировать их, например, в нейроны и смотреть, что там «сломалось». С нейронами, кстати, получается особенно удачно, они хорошо развиваются из ИПСК. Эрдэм Дашинимаев рассказал про работу своей группы, в которой выяснилось, что в нейронах, полученных из ИПСК пациента с болезнью Дауна, накапливаются патологические бета-амилоиды, маркеры болезни Альцгеймера. Наконец, на ИПСК можно тестировать потенциальные лекарства.

А каковы перспективы применения ИПСК для лечения? Здесь есть несколько путей. Можно получить ИПСК от пациента, скорректировать в них генетический дефект, дифференцировать в нужный клеточный тип и пересадить пациенту. Так, были получены культуры для лечения нейродегенеративных заболеваний, макулярной дистофии, культура бета-клеток поджелудочной железы. Но пока только в одной работе (группы Яманаки) пациентке с макулярной дистрофией были пересажены выращенные из ИПСК клетки, и это, к сожалению, не привело к восстановлению зрения. Во многих лабораториях ведутся работы по получению бета-клеток поджелудочной железы для лечения диабета.

Дашинимаев рассказал и о перспективах выращивания органов с помощью ИПСК. Пока что удалось по технологии получения химерных животных вырастить поджелудочную железу крысы в организме мыши. Для этого в бластоцист мыши, генетически лишенной поджелудочной железы, помещали клетки крысы; таким же образом вырастили сосуды и легкие. Но для выращивания органов человека мышь не подходит, нужны крупные животные. Со свиньями пока не очень получается, генетически они слишком сильно отличаются от человека. Специалисты работают над этой проблемой, один из подходов для ее решения — это «гуманизация» свиней, получение трансгенных животных с генами человека. Такие работы возможны, потому что в 2016 году был снят мораторий на исследования химерных «гуманизированных» животных.

На вопрос PCR.NEWS о том, как перспективы использования ИПСК соотносятся с реальностью, Эрдэм Баирович ответил, что пока нет ни одной технологии, одобренной для внедрения в клинику. Одна из проблем состоит в том, что ИПСК в культуре накапливают мутации, которые обеспечивают им победу в пролиферативной гонке:

— Когда вы берете фибробласты и получаете линию ИПСК, они проходят много циклов пролиферации, в них побеждают те клоны, которые научились подавлять гены, мешающие пролиферации, например ген р53, «страж генома». Было исследование, в котором проанализированы сотни линий ИПСК и показано, что на поздних пассажах 30-40% клеток несут значимые онкогенные мутации. К тому же нередко возникают и хромосомные абберации, поэтому ИПСК должны проходить кариотипирование.

Конечно, культуры ИПСК проверяют на онкогенные мутации и на кариотип, и в работе Яманаки и его коллег с макулодистрофией из множества линий ИПСК только одна была доведена до трансплантации пациентке. Лектор отметил, что «в этой ложке дегтя есть капля меда»: тератомы, которых больше всего боятся, не сильно растут, чаще иммунитет их убивает, несмотря на пациент-специфичность генома.

Решением этой проблемы может быть создание стандартизованных линий ИПСК, которые не несут мутаций. Однако, хотя такие «хорошие» линии будут аллогенными, не аутологичными. Поэтому нужно будет что-то придумывать, чтобы они не отторгались после трансплантации. Так, бета-клетки поджелудочной железы собираются инкапсулировать, чтобы защитить от иммунитета. В общем, проблемы с клиническим применением ИПСК есть, и люди работают над их решением.