Новая платформа для высокопроизводительной детекции коронавируса

Канадские ученые разработали мультиплексную автоматизированную платформу для детекции РНК SARS-CoV-2 в клинических образцах с одновременным секвенированием амплифицированных последовательностей. Платформа получила название C19-SPAR-Seq (Systematic Parallel Analysis of RNA coupled to Sequencing for Covid-19 screening).

Система основана на NGS-технологии SPAR-Seq, разработанной этой же командой ранее. На первом этапе проводится обратная транскрипция, а затем ПЦР для выявления РНК SARS-CoV-2 в образце с использованием мультиплексной смеси праймеров. В качестве мишеней изначально были выбраны гены РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP), нуклеокапсида (N), белка оболочки (E), два сайта гена S-белка, соответствующие рецептор-связывающему домену (Srbd) и многоосновному сайту расщепления (Spbs), а также праймер к человеческому гену в качестве контроля. Последние две мишени захватывают последовательности, специфичные именно для SARS-CoV-2, тогда как праймер к RdRP сработает и в случае вируса SARS-CoV, распознать который можно с помощью секвенирования.

После амплификации на 5’- и 3’-концы полученных фрагментов ДНК навешиваются штрихкоды, а затем проводится секвенирование и анализ результатов.

Первичную проверку и доработку платформы C19-SPAR-Seq проводили на архивных образцах, хранящихся в больнице Маунт-Синай сети здравоохранения Университета Торонто. Для того, чтобы анализ удовлетворял строгим критериям клинической диагностики, авторы при каждом запуске использовали большое количество контрольных образцов, а также внедрили в систему алгоритм, назначающий пороговые значения для каждого цикла и оценивающий качество выходных данных. В процессе валидации на пилотной выборке из 89 коронавирус-положительных и 289 коронавирус-отрицательных образцов авторы обнаружили, что увеличение количества отрицательных образцов создает шумы в результатах C19-SPAR-Seq из-за большого количества неспецифических продуктов амплификации.

Ученые оптимизировали набор праймеров: изменили таргетную область RdRP и убрали праймеры к N и E. С этим наборов они протестировали C19-SPAR-Seq на расширенной выборке из 663 архивных образцов (назофарингеальных мазков и бронхоальвеолярного лаважа), для 98 из которых ранее было подтверждено наличие РНК SARS-CoV-2. Распределение ридов для положительных и отрицательных образцов четко различалось, при этом внутренняя система контроля C19-SPAR-Seq посчитала результат для 121 образца незначимым. В основном это были образцы БАЛ. Ученые заключили, что образцы БАЛ сильно деградируют со временем и что внутренняя система контроля C19-SPAR-Seq хорошо определяет образцы ненадлежащего качества.

В целом чувствительность и специфичность C19-SPAR-Seq составили 87% и 100% соответственно; для образцов с высокой вирусной нагрузкой — >95% и 100%. По словам авторов, платформу можно масштабировать до десятков тысяч образцов на один запуск.

«Она исключительно надежна и адаптируема, — говорит один из авторов работы Хавьер Эрнандес, младший исследователь в Институте Люненфельда-Таненбаумов (Торонто). — Цикл занимает около 24 часов. Процесс очень прост, и мы автоматизировали практически каждый его шаг».

Ученые считают, что в перспективе C19-SPAR-Seq может применяться для крупномасштабного мониторинга SARS-CoV-2 и других патогенов.