«Открытая» система для выявления вирусных РНК на основе RT-LAMP может сделать диагностику доступнее

Методы in vitro обнаружения нуклеиновых кислот крайне важны для борьбы с вирусными инфекциями. Большинство медучреждений полагаются на коммерческие продукты, оптимизированные для получения стабильных и точных результатов. Однако такие наборы обычно дорогостоящи, что затрудняет их использование для контроля крупных инфекционных вспышек, особенно для лабораторий с ограниченными ресурсами. Также затруднительна доставка коммерческих продуктов в страны, не являющиеся частью устоявшейся транспортной сети. Международная группа ученых представила общедоступную диагностическую систему, призванную решить эти проблемы.

Авторы прибегли к методу петлевой изотермической амплификации с обратной транскрипцией (RT-LAMP). RT-LAMP позволяет проводить обратную транскрипцию и амплификацию ДНК в одной пробирке при постоянной температуре, а визуальное считывание результатов (присутствие или отсутствие целевого патогена в образце) опирается на изменение окраски смеси.

Набор ферментов для проведения RT-LAMP включил ДНК-полимеразу (изолированную от Geobacillus stearothermophilus), обратную транскриптазу (от ВИЧ-1) и урацил-ДНК-гликозилазу (применяется для удаления контаминантов; от психротрофной морской бактерии BMTU 3346). В лабораторных тестах на синтетической РНК SARS-CoV-2 «домашний» микс ферментов показал чувствительность, сопоставимую с коммерческими наборами — 100% для 50 копий/мкл; 85% для 25 копий/мкл. Доработка протокола с использованием магнитных частиц позволила повысить предел обнаружения до 3,125 копий/мкл. Векторы для экспрессии разработанных ферментов в E. coli и протоколы для их лабораторного получения выложены авторами в открытый доступ в базу данных Addgene и на собственный сайт группы.

Кроме непосредственно набора ферментов авторы также разработали протокол инактивации образцов с использованием Трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорида (TCEP), позволяющий опустить дорогостоящий и трудозатратный шаг выделения РНК.

Для тех случаев, когда невозможно или крайне затруднительно поддержание холодовой цепи, требуемой для доставки реактивов в лаборатории, исследователи создали лиофилизированные смеси в двух вариантах. Один содержит только ферменты, другой включает также dNTP и праймеры. В лабораторных тестах лиофилизированные смеси сохраняли свойства на уровне свежих смесей после хранения в течение 40 дней при различных температурах.

Для оценки диагностических возможностей разработанной системы авторы использовали образцы от 192 пациентов, собранных в медучреждениях Вены. Образцы тестировали на SARS-CoV-2 с помощью новой системы и с помощью количественной ОТ-ПЦР. Для 80 образцов ПЦР тест показал положительный результат. Из них новая система показала положительных результат для 52 образцов, не дав ложноположительных результатов (чувствительность 65%, специфичность 100%), а 50% предел обнаружения (LOD50) соответствовал приблизительно 100 копиям вирусной РНК на реакцию.

Аналогичный тест провели в исследовательском центре в Гане (Западная Африка), куда были отправлены лиофилизированные смеси. На 200 протестированных образах смесь достигла чувствительности в 90% и специфичности в 100%.

Представленную систему для проведения быстрых и экономных диагностических тестов, можно производить непосредственно в месте планируемого применения или же доставлять туда в готовом виде. Авторы считают, что их разработка поможет обеспечить глобальный доступ к методам диагностики и сдерживания вирусных инфекций.

Автономный чип выявляет туберкулезную палочку у ВИЧ-положительных людей лучше стандартного анализа