Препарат на основе CRISPR-Cas13a ингибирует вирус гриппа и коронавирус in vivo

Ученые из нескольких научных организаций штата Джорджия (США) разработали противовирусное средство на основе Cas13a и проверили его на хомячках и мышах.

Cas13a — это нуклеаза семейства Cas13, расщепляющая РНК. Она работает в комплексе с CRISPR-РНК (crРНК), специфичной к последовательности-мишени. В лабораторных экспериментах нуклеаза Cas13a используется для таргетного нокдауна генов. Кроме того, на ее основе разрабатываются инструменты для высокочувствительной диагностики COVID-19, в том числе на платформе SHERLOCK. Специфическая РНКазная активность Cas13a предполагает возможность ее применения для борьбы с РНК-вирусами, однако до сих пор не решена проблема доставки нуклеазы в клетки.

Авторы нового исследования использовали синтетическую мРНК, кодирующую Cas13a и заключенную вместе с crРНК в наночастицы из гиперразветвленных полиаминоэфиров (PBAE). Эти наночастицы были разработаны ранее группой ученых из Массачусетского технологического института специально для доставки терапевтической мРНК в ингаляционной форме через небулайзер. Метод опробовали на мышах, зараженных вирусом гриппа А, и на сирийских хомячках, инфицированных SARS-CoV-2.

Для таргетной борьбы с респираторными патогенами ученые выбрали crRNA, специфичные к высококонсервативным генам субъединиц полимеразы PB1 и PB2 вируса гриппа А и к генам РНК-зависимой РНК-полимеразы и нуклеокапсида вируса SARS-CoV-2. Система мРНК Cas13a – crРНК эффективно ингибировала вирус гриппа в культуре клеток A549 и коронавирус в клетках Vero E6 и Huh7. При этом ученые продемонстрировали возможность использования комбинации из двух crРНК, нацеленных на разные гены.

Для экспериментов in vivo ученые сконструировали небулайзер, к которому можно присоединить камеры для трех мышей или двух хомячков. Мышей заражали вирусом гриппа A интраназально и через шесть часов вводили им 100 мг мРНК Cas13a вместе с crРНК к гену PB1, заключенные в PBAE-частицы. Через три дня мышей умерщвляли и анализировали количество РНК вируса в легких. У животных, получивших препарат, уровень РНК вируса гриппа в легких был на 96,2% ниже, чем у мышей из контрольной группы, не получивших ингаляцию. Кроме того, мыши из группы препарата меньше теряли в весе после заражения.

Схема опыта с хомячками была иной. Хомячкам сначала вводили мРНК Cas13a и crРНК к гену нуклеокапсида SARS-CoV-2, а через 20 часов заражали коронавирусом интраназально. Эвтаназию проводили через 6 дней. Было показано, что в легких хомячков, получивших препарат, снижен уровень экпрессии гена нуклеокапсида вируса по сравнению с контрольной группой. Кроме того, хомячки из группы препарата демонстрировали прибавку в весе, сопоставимую с динамикой веса неинфицированных хомячков, тогда как вес инфицированных хомячков, не получивших ингаляцию, почти не увеличился. Авторы отмечают, что снижение вирусной нагрузки в легких хомячков из группы препарата было незначительным, однако считают выборку (4 хомячка) недостаточной большой для однозначных выводов.

Таким образом, впервые продемонстрирована специфическая противовирусная активность нуклеазы из семейства Cas13 in vivo. Использование синтетической мРНК имеет ряд преимуществ: быстрая деградация снижает вероятность ее встраивания в геном, а оптимизация последовательности позволяет уменьшить реакцию врожденного иммунитета на препарат. Это дает возможность вводить препарат многократно. Ученые считают, что подход применим и для других инфекций, и планируют дальнейшую разработку систем доставки мРНК в легкие.