Разработан метод для оценки возраста молекул РНК

Метод секвенирования РНК единичных клеток сам по себе дает относительно немного информации о динамике экспрессии генов. В новой статье, опубликованной в Nature Biotechnology, сообщается о разработке нового метода, позволяющего в ходе секвенирования РНК определять возраст отдельных молекул РНК. Идея метода состоит во внесении в РНК временных меток с помощью аденозиндезоминазы ADAR2, сшитой с капсидным белком фага MS2.

Авторы метода предлагают пришивать к интересующим молекулам РНК специальную последовательность (тэг). В этой последовательности в течение существования РНК будут постепенно накапливаться остатки инозина, полученные из аденина под действием каталитического домена аденозиндезаминазы ADAR2. Доставку аденозиндезаминазного домена к тэгу осуществляет сшитый с ним капсидный белок вируса MS2 — для этого в тэг вводится последовательность, распознаваемая этим белком. Превращение аденина в инозин, катализируемое химерным белком ADAR2-MS2, впоследствии может быть выявлено как точечная замена аденина на гуанин.

Для калибровки системы ученые культивировали клетки линии HEK293T, экспрессирующие систему ADAR2-MS2. Тэг, в который вносятся временные метки, включили в состав 3’-некодирующей области мРНК, кодирующей флуоресцентный белок (известно, что эта мРНК не разрушается в клетках млекопитающих на протяжении как минимум 12 часов). Далее транскрипцию в клетках остановили с помощью актиномицина D, лизировали клетки и произвели секвенирование тотальной РНК. Анализ РНК показал, что, действительно, с течением времени молекулы РНК с тэгом подвергались редактированию, а по числу актов редактирования можно оценить возраст молекулы РНК с 95% доверительным интервалом 2,7 ± 0,4 часа. Авторы исследования разработали алгоритм, который выводит транскрипционную программу (функцию, которая описывает количество временных меток в зависимости от времени) для каждой РНК на основе накопления в ней следов редактирования.

Исследователи продемонстрировали, что разработанный ими метод может применяться и для изучения таких пластичных процессов, как активность нейронов, с временным разрешением. Они показали, каким образом изменяется экспрессия белка c-Fos в первичной культуре нейронов гиппокампа под действием хлорида калия. Более того, новый метод для оценки сроков жизни молекул РНК может применяться и на одиночных клетках. Остается, однако, неясным, будет ли калибровка временной шкалы, полученная для одной клеточной системы на основании следов редактирования РНК, работать для других систем.