Тест на коронавирус без обратной транскрипции работает быстрее ОТ-ПЦР

Ученые из Бирмингемского университета, его дочерней компании Linear Diagnostics и IT-компании C2JF Solutions разработали ультрабыстрый тест для определения РНК SARS-CoV-2, основанный на экспоненциальной амплификации без обратной транскрипции (reverse transcription free — exponential amplification reaction, RTF-EXPAR).

Как отмечают авторы, ОТ-ПЦР-тесты на РНК коронавируса занимают не меньше 60 минут, при этом до 30 из них уходит на реакцию обратной транскрипции. Антигенный тест занимает 30 минут, но уступает ПЦР-тестам в точности и чувствительности. Изотермическая амплификация ДНК позволяет сократить время за счет увеличения скорости реакции, поэтому в последнее время активно используется в разработках новых методик тестирования, например, в системе RT-LAMP.

Новый тест использует изотермический метод EXPAR (реакцию экспоненциальной амплификации) в комбинации с RTF(reverse transcription free) — этапом, на котором РНК конвертируется в ДНК без реакции обратной транскрипции.

Процесс начинается с того, что небольшой одноцепочечный фрагмент ДНК (триггер) связывается с матрицей, содержащей две последовательности ДНК, комплементарные триггеру и разделенные сайтом расщепления, который распознает никаза. На матрице ДНК-полимераза синтезирует олигонуклеотиды, которые разрезаются никазой и диссоциируют, освобождая матрицу с триггером для новой реакции.

В системе, представленной в работе, в качестве триггера использовали 17-нуклеотидную последовательность, комплементарную консервативному участку гена Orf1ab вируса SARS-CoV-2.

Для конверсии вирусной РНК в ДНК сконструировали 30-членный олигонуклеотид Binder DNA (связывающая ДНК), в состав которого вошла последовательность триггера и частично перекрывающая ее последовательность, комплементарная части Orf1ab. Эти две последовательности разделены сайтом, который узнает рестриктаза BstN1. Этот фермент может работать как никаза для РНК/ДНК дуплексов. BstN1 связывается с вирусной РНК, расщепляет ДНК в составе дуплекса и высвобождает триггер из Binder DNA.

 Схема метода RTF-EXPAR. Credit: Jake Carter, et al., 2021; DOI: 10.1073/pnas.2100347118 | CC BY 4.0

В тесте все реагенты добавляются сразу в одну пробирку. На первой стадии анализа происходит связывание Binder DNA с вирусной РНК и расщепление дуплекса рестриктазой. Процесс идет при 50° C примерно четыре минуты. На второй стадии высвободившийся триггер связывается с матричной ДНК, запуская EXPAR. Общее время реакции зависело от концентрации вирусной РНК, но не превышало 10 минут.

Сравнение RTF-EXPAR, RT-LAMP и ОТ-ПЦР показало, что при концентрации вирусной РНК от 7,25 копий/мкл и выше RT-EXPAR проходит быстрее RT-LAMP (8–10 минут против 11–15 минут). Обе изотермические реакции значительно превосходили в скорости ОТ-ПЦР. Высокую специфичность теста подтвердили на образцах нуклеиновых кислот SARS-CoV-2 и других респираторных патогенов.

Тест также был апробирован в Лаборатории хирургических исследований Бирмингенского университета на мазках с типичным диапазоном вирусных нагрузок.

«Анализ показал, что чувствительность RTF-EXPAR эквивалентна количественному тесту ПЦР, с прогностической ценностью положительного результата 89% и прогностической ценностью отрицательного результата 93%. Мы планируем опубликовать полные результаты этого тестирования в ближайшем будущем», — говорит один из авторов работы профессор Эндрю Беггс, команда которого проводила апробацию теста.