Улучшенное метагеномное секвенирование для детекции вирусов

В Nature Microbiology опубликован новый универсальный метод таргетного обогащения образцов, основанный на метагеномном секвенировании нового поколения и предназначенный для выявления вирусов. Обогащение используют, чтобы перед секвенированием сконцентрировать в образце нужные участки генома, повышая таким образом чувствительность метода.

Метагеномное секвенирование с обогащением путем добавления праймеров (metagenomic sequencing with spiked primer enrichment, MSSPE) позволяет концентрировать целевые вирусные нуклеотидные последовательности, сохраняя при этом чувствительность метагеномного анализа к другим патогенам. Исследователи протестировали MSSPE на 14 разных вирусах в клинических образцах с низким титром возбудителя и получили в среднем десятикратное обогащение образцов по сравнению со стандартным метагеномным секвенированием нового поколения. Широта охвата генома увеличилась на 47%.

Новый метод выглядит следующим образом. Для диагностики каждого вируса разрабатываются специфичные праймеры на основе референсных геномов (spiked primers). Длина каждого праймера — 13 нуклеотидов. Эти праймеры добавляют в реакционную смесь, состоящую из обработанной нуклеазами тотальной РНК, выделенной из образца, и случайных праймеров (random primers), проводят обратную транскрипцию и готовят библиотеки с помощью ПЦР. В результате количество таргетных участков вирусных геномов увеличивается. После этого образец секвенируют, а результаты обрабатывают c помощью вычислительного протокола для идентификации патогенов SURPI (sequence-based ultrarapid pathogen identification).

Точность секвенирования с применением нового метода обогащения составила 95% для выявления вирусов Зика, Эбола, денге, чикунгунья и желтой лихорадки в образцах плазмы крови пациентов. По эффективности это сравнимо со специфическим ПЦР-анализом, который используют для детекции арбовирусов (вирусов, переносимых членистоногими) и геморрагической лихорадки. При этом MSSPE дешевле, быстрее и может работать на настольных секвенаторах Illumina или портативных нанопоровых приборах, что позволяет применять его в диагностических лабораториях и в полевых условиях.