Внутриклеточный конструктор из РНК-нанозвезд

Безмембранные органеллы — каплевидные скопления белков и РНК в клетке — известны как биомолекулярные конденсаты. Они формируются по мере необходимости и могут специфично накапливать те или иные молекулы, способствуя протеканию внутриклеточных реакций. Искусственные конденсаты — перспективный инструмент для синтетической биологии, с помощью которого можно регулировать биохимические процессы и активность генов в клетке.  Авторы статьи в Nature Nanotechnology предложили создавать искусственные конденсаты из модульных РНК-мотивов, способных к самосборке внутри живых клеток млекопитающих.

Недавно была описана сборка РНК-нанозвезд — конденсатов из коротких (100–200 нуклеотидов) одноцепочечных РНК. Они состоят как минимум из трех шпилек, функционирующих как «руки». Петлевые домены этих шпилек специфично связываются с петлями другой нанозвезды, формируя так называемую структуру «целующихся петель» (kissing loops, KL) — именно это взаимодействие обеспечивает сборку в конденсат. Как правило, их последовательности палиндромны и идентичны на каждой руке. Модульная конструкция нанозвезд позволяет добавлять в них домены для привлечения малых молекул и белков. Теперь ученые показали, что с помощью РНК-нанозвезд можно создавать в живой клетке конденсаты с регулируемым характером смешивания, а также продемонстрировали способ управлять их локализацией. 

Сперва авторы получили нанозвезды из одноцепочечной РНК в линиях клеток человека (HEK293T, HeLa и U-2OS). Конструкция содержала три 15-нуклеотидных руки, каждая с 6-нуклеотидным KL-мотивом UCGCGA. Для повышения стабильности использовали систему экспрессии Tornado, которая обеспечивает спонтанную циклизацию РНК. В одну из рук ученые встроили аптамер Broccoli, чтобы визуализировать РНК в клетках при помощи флуорогенного лиганда этого аптамера, DFHBI (3,5-дифтор-4-гидроксибензилиденимидазолинона). Такая конструкция нанозвезды генерировала конденсаты во время транскрипции in vitro. 

Встроенные в РНК-нанозвезду аптамеры могут служить не только для визуализации, но и для привлечения других молекул в состав конденсата. Ученые продемонстрировали это на аптамере из генома бактериофага MS2 — в норме данная структура связывается с белком оболочки фага (MCP). Аптамер встроили в нанозвезду и экспрессировали ее в клетках одновременно с MCP, помеченным флуоресцентным белком mCherry. Микроскопия подтвердила, что MCP-mCherry накапливался в РНК-конденсатах. 

Исследователи оценили скорость диффузии mCherry в полученных конденсатах по восстановлению флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP). Они сравнили динамику флуоресцентных меток mCherry, Broccoli и Pepper (еще одного аптамера с флуорогенным лигандом) в цитоплазме и в ядре клеток. Диффузия в ядре, судя по всему, происходила быстрее, однако флуоресценция mCherry восстанавливалась слабее, чем в цитоплазме, возможно, из-за внутриклеточной локализации самой метки. Также авторы заключили, что РНК-конденсаты обладают относительно высокой вязкостью. 

Кроме того, ученые показали, что конструкция РНК-нанозвезды определяет внутриклеточную локализацию конденсатов. Вариант KL с самым сильным связыванием приводил к образованию крупных конденсатов в ядре и множества мелких точечных образований в цитоплазме. Напротив, слабые варианты KL в основном формировали конденсаты снаружи ядра. В целом увеличение числа рук или их длины способствовало привлечению нанозвезд в ядро. Варианты с более сильными KL или большим числом рук формировали в ядре крупные конденсаты, но их абсолютное количество было меньше. 

Специфичность взаимодействий между петлями позволяет также оптимизировать РНК-нанозвезды таким образом, чтобы получать в одной клетке несколько разных конденсатов, которые не будут взаимодействовать друг с другом. Авторы продемонстрировали это на трех различных нанозвездах — каждая содержала свою последовательность KL и свой флуорогенный аптамер (Broccoli, Pepper и Mango, дающие зеленую, красную и желтую флуоресценцию соответственно). Одновременная экспрессия всех трех конструктов приводила к появлению конденсатов, которые отличались по локализации в клетке в зависимости от структуры соответствующей нанозвезды.

В работе описана простая и управляемая стратегия сборки РНК-конденсатов в живых клетках млекопитающих — короткие одноцепочечные РНК сворачиваются в звездообразные структуры, а рациональный дизайн их последовательностей позволяет направить нанозвезду в нужный клеточный компартмент, настроить размер конденсата или обеспечить привлечение в него целевого белка. 

Фаги микобактерий с полностью синтетическими геномами оказались жизнеспособными