Коктейль из четырех ферментов убивает микобактерии

Нетуберкулезные микобактерии (NTM) представляют собой оппортунистические патогены, которые филогенетически и клинически родственны микобактериям туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis). У людей с ослабленным иммунитетом они могут вызвать заболевания кожи или легких. От NTM сложно избавиться из-за особенностей строения клеточной стенки и способности скрываться в клетках-хозяевах (часто макрофагах). Все это приводит к частым рецидивам, тяжелому лечению и растущей смертности. В статье, опубликованной в Microbiology Spectrum, исследователи из США предложили новый подход для лечения туберкулеза и создали биологический препарат из нескольких ферментов.

Эндолитический коктейль 1 (EC1) включает в себя четыре фермента: лизины LysA и LysB, изоамилазу и α-амилазу, которые каталитически атакуют три слоя микобактериальной оболочки. LysA из бактериофагов расщепляет пептидогликановый слой (PG), тогда как LysB представляет собой сериновую эстеразу, которая гидролизует связь между арабиногалактаном (AGL) и миколевыми кислотами. Изоамилаза и α-амилаза разрушают внеклеточную капсулу (CL) микобактерий и обеспечивают доступ к субстратам LysA и LysB.

Разработка литического коктейля для микобактерий велась с помощью поиска гомологии и доменной идентификации геномов микобактериофагов. Для поиска ферментов LysA и LysB была использована база генов микобактериофагов PhagesDB. Ученые выбрали микобактериофаг Yunkel11, чей фермент LysA оказался наиболее термостабильным и легко изолируемым. Аналогичным образом был найден фермент LysB, который был взят из микобактериофага D29.

Поиск изоамилазы и α-амилазы для разрушения CL был проведен в базе CAZy. В результате донорами ферментов стали Rhizomucor pusillus и Candida glabrata.

Стабильность EC1 была подтверждена спектроскопией с термическим анализом. По отдельности компоненты коктейля имели температуру агрегации (T_agg) более 45°C и температуру плавления (T_m) более 46°C. В то же время в виде сборного препарата ферменты обладали T_agg более 47°C и T_m более 53°C, что указывает на стабильность белков.

Для оценки бактерицидных свойств EC1 исследователи сравнили его с действием одного фермента LysB при нанесении на M. abscessus. Критерием эффективности выступали оставшиеся колониеобразующие единицы (КОЕ). Минимальная ингибирующая концентрация значительно снизилась при использовании коктейля. Эффективность препарата повышалась при снижении pH.

EC1 показывает высокую бактерицидную активность в отношении как быстрорастущих M. abscessus, так и медленно растущих M. avium, M. intracellulare и M. tuberculosis. Авторы изучили поведение препарата при применении со стандартными антибиотиками (SoC). В результате были выявлено резкое снижение требуемых доз антибиотиков in vitro, что указывает на синергизм препаратов. Наиболее эффективными оказались комбинации с амикацином, цефокситином и рифампицином. В этих случаях требуемая доза SoC-препарата могла быть уменьшена до 640 раз.

Коктейль из ферментов инкапсулировали в липосомы с помощью микрофлюидного чипа NextGen и получили препарат ENTX_001. Липосомы состоят из физиологических липидов, включая фосфатидилсерин, который стимулирует захват макрофагами. Чтобы оценить состояние макрофагов мыши, инфицированных M. abscessus, авторы использовали флуоресцентную микроскопию. Инкапсулированная форма препарата продемонстрировала более мощную защиту макрофагов от некроза, чем свободная ферментативная смесь.

Чтобы оценить степень защиты макрофагов от некроза, исследователи инфицировали клеточные линии макрофагов человека бактерией M. avium. Состояние макрофагов определяли методом проточной цитометрии. ENTX_001 защищал макрофаги человека и мыши. При этом исследователи отметили, что защита ENTX_001 была мощнее и длилась дольше, чем ферментного коктейля EC1.

Исследование показывает, что EC1 может убивать микобактерии. Действие препарата, в отличие от классических низкомолекулярных антибиотиков, направлено на разрушение сразу трех слоев клеточной стенки. EC1 также не ограничен рецепторами, как бактериофаги, что расширяет диапазон его применения. Наконец, синергизм при применении с SoC-препаратами снижает токсичность лечения и увеличивает его эффективность.

Олигоэлектролит уничтожает покоящиеся клетки нетуберкулезной микобактерии