Жизнь терапевтической мРНК продлил ветвистый хвост

Исследователи из Института Бродов и Массачусетского технологического института (MIT) предложили новый подход к синтезу мРНК для терапевтических применений. Лекарственные препараты на основе мРНК в последнее время приобрели широкую известность. Быстрая разработка мРНК-вакцин против COVID-19 продемонстрировала их ключевые преимущества: программируемость, масштабируемость и простоту разработки и продукции. Появился интерес к другим применениям. Например, была протестирована в ранних клинических испытаниях мРНК паракринного фактора роста эндотелия сосудов VEGF-A для лечения сердечной недостаточности, а также мРНК редактора оснований CRISPR-Cas9 для коррекции мутаций в гене белка PCSK9, вызывающих гетерозиготную семейную гиперхолестеринемию. (Подробнее о разработке CRISPR-системы для лечения гиперхолестеринемии на PCR.NEWS.)

Однако мРНК для продукции дефектных из-за мутаций белков, антител или CRISPR-системы должны сохраняться в организме дольше, чем те мРНК, которые входят в состав вакцин. Иначе не удастся обеспечить стабильно высокие количества нужного белка. Повышение дозы мРНК может сделать препарат цитотоксичным. Многие исследователи пытаются увеличить продолжительность и уровень экспрессии белков с терапевтических мРНК. Эту цель преследует и решение, принесшее Нобелевскую премию разработчикам мРНК-вакцин — замена в составе мРНК уридина (U) на N1-метилпсевдуридин (m1ψ). Среди других стратегий — использование кольцевых и самоамплифицирующихся РНК, но и у них есть ряд ограничений

Команда из Института Бродов и MIT предложила принципиально новую структуру мРНК с несколькими поли(А)-хвостами, химически модифицированными. Участок на 3’-конце мРНК, называемый поли(А)-хвостом, играет важную роль в ее защите от разрушения внутри клеток. После окончания транскрипции к первичной мРНК специальный фермент прикрепляет адениновые основания, образуя цепочку ААААА… Укорочение поли(А)-хвоста ферментом деаденилазой приводит к деградации мРНК, наращивание увеличивает время ее жизни.

Ранее авторы работы показали, что если ввести в поли(А)-хвост модифицированные олигонуклеотиды, придающие ему устойчивость к деаденилазе, это увеличивает продукцию белка в культуре клеток. В новой работе они пошли еще дальше и создали мРНК сложной формы, с ветвистым концевым участком, который содержит несколько модифицированных поли(А)-хвостов. Ветвление обеспечили специальные модификации нуклеотидов в «стволовой» цепочке, присоединение боковых хвостов осуществлялось химическим путем. «Мы показали, что неприродные структуры могут функционировать намного лучше, чем природные», — говорит руководитель работы Сяо Ван.

Авторы сравнили, как влияют разветвленные хвосты с различной химией и топологией на эффективность трансляции. Наилучшей была признана конструкция с двумя типами химических модификаций и тремя боковыми поли(А)-ветвями — продукция репортерного белка в культуре клеток через три часа выросла в 20 раз по сравнению с контролем и в целом была намного более продолжительной. Разветвленный хвост длительное время оставался стабильным.

После экспериментов на клетках конструкцию испытали на мышах. Многохвостые РНК в липидных наночастицах вводили животным заглазнично. Была показана низкая токсичность и повышенная по сравнению с другими мРНК продукция белка. Сигнал in vivo наблюдался до 14 дней.

Затем авторы проверили, может ли быть эффективной терапевтическая мРНК, кодирующая CRISPR-систему. Эксперимент проводили на клетках, кодирующих зеленый флуоресцентный белок, а CRISPR-Cas9 были нацелены на его ген и успешно подавляли флуоресценцию. Аналогичным образом авторы снизили у мышей уровни Pcsk9 и Angptl3 — белков-мишеней при терапии семейной гиперхолестеринемии. У животных также понизился уровень липидов и свободного холестерина в крови, причем все показатели превосходили контроли.

Таким образом, ветвистые мРНК представляются перспективными кандидатами на роль терапевтических препаратов следующего поколения. Авторы предполагают, что дополнительные модификации мРНК могут не только повысить стабильность, но и улучшить показатели транслируемости, специфичности, доставки и фармакокинетики.

В настоящее время ученые сосредоточены на том, чтобы сделать процесс синтеза и очистки мРНК с поли(А)-хвостами масштабируемым, и продолжают изучать влияние модификаций мРНК на ее стабильность и активность.

Разработали новый полимер для аэрозольной доставки мРНК в легкие