Четырехбуквенный код: как расширить спектр аминокислот в синтезируемом белке

Расширение генетического кода, позволяющее встраивать в синтезируемый белок неканонические аминокислоты, — перспективный инструмент для изучения биологических процессов и управления ими. Для него необходимы два компонента: аминоацил-тРНК-синтетаза, способная использовать заданные исследователем неканонические аминокислоты, и «пустые» кодоны, которые будут кодировать эти аминокислоты в ходе трансляции. Один из подходов состоит в использовании квадруплетных кодонов, которые вместо трех нуклеотидов содержат четыре. Ранее коллектив под руководством Ахмеда Бадрана из Исследовательского института Скриппса (США) получил в клетках Escherichia coli систему трансляции, основанную на квадруплетных кодонах. В новой работе эти же ученые проанализировали влияние локального контекста последовательности на трансляцию в такой системе.

Декодирующие тРНК (qtRNA) могут считывать искусственный четырехнуклеотидный кодон, что приводит к сдвигу рамки считывания на один нуклеотид и восстановлению открытой рамки считывания во время трансляции. Трансляция квадруплетных кодонов позволяет включать разнообразные неканонические аминокислоты в состав белка, но проходит менее эффективно, чем считывание «классических» трехнуклеотидных кодонов. Для изучения роли контекста авторы экспрессировали в клетках E. coli sfGFP (зеленый флуоресцентный белок с повышенной эффективностью фолдинга, superfolder GFP). Один из кодонов (в позиции Y151) они заменили квадруплетным и варьировали частоту использования кодонов в ближайших пяти остатках в ту или иную сторону. В качестве контроля этот же кодон заменили на UAG — исторически сложилось так, что именно этот стоп-кодон применяют для расширения генетического кода и кодирования неканонических аминокислот. Сортировка клеток по экспрессии sfGFP показала, что уровень этого белка сильнее варьировал при декодировании квадруплетных кодонов, то есть оно было более чувствительно к локальному контексту последовательности.

Важный аспект расширения генетического кода — это возможность мультиплексирования, то есть введения нескольких уникальных неканонических аминокислот в один белок. Для этого требуются взаимно ортогональные пары тРНК-синтетаз. Авторы работы убедились в такой возможности, проанализировав встречающиеся у E. coli тРНК-синтетазы — они количественно оценили декодирование в различных сочетаниях 25 тРНК-синтетаз и 32 тРНК (всего 800 комбинаций). Из этих пар 69 работали с эффективностью более 20%, причем часть из них специфично встраивала в растущую полипептидную цепь неканонические аминокислоты.

Из них исследователи отобрали пять взаимно ортогональных пар тРНК-синтетаз для включения неканонических аминокислот и оптимизировали их активность по декодированию квадруплетных кодонов. Для этого они воспользовались направленной эволюцией. При этом авторы работы учли, что выгодно было бы использовать тРНК-синтетазы, способные включать более одной неканонической аминокислоты. Анализ таких тРНК-синтетаз, потенциально способных включать не менее трех неканонических аминокислот с эффективностью более 10%, выявил варианты пяти ферментов, обеспечивающих доступ к 47 уникальным аминокислотам.

Затем ученые оптимизировали продукцию декодирующих квадруплексы тРНК (qtRNA) из мультицистронной кассеты. Они вводили в E. coli кассету с 4 qtRNA и проанализировали геном бактерии на предмет наличия спейсерных последовательностей длиной 20–60 нуклеотидов, которые позволили бы ввести также пятую qtRNA. Один из полученных вариантов обеспечивал эффективное декодирование квадруплексных кодонов для всех пяти оптимизированных qtRNA.

Макроциклические пептиды, содержащие неканонические аминокислоты, перспективны для получения молекул с новыми заданными свойствами или определения функций белков. Получение целого спектра таких макроциклов стало возможным благодаря аминоацилированию тРНК in vitro и бесклеточным системам трансляции. Теперь же авторы работы изучили стратегию внутриклеточного биосинтеза макроциклических пептидов и объединили ее с системой встраивания неканонических аминокислот. Круговое лигирование пептидов и белков осуществлялось с использованием интеина Nostoc punctiforme (нитчатой цианобактерии). В общей сложности ученые получили 50 макроциклических пептидов, содержащих по одной уникальной неканонической аминокислоте. Авторы работы не остановились на достигнутом — они попробовали включать в макроциклы повторяющиеся неканонические аминокислоты. В итоге им удалось получить 72 молекулы, содержащие по две ли три неканонических аминокислоты, причем синтез не требовал этапа тщательной очистки. В частности, они синтезировали 17 макроциклов, несущих три последовательных неканонических аминокислотных остатка.

«Эти циклические пептиды похожи на биологически активные малые молекулы, которые встречаются в природе, — комментирует руководитель исследования Ахмед Бадран. — Используя программируемость синтеза белка и разнообразие строительных блоков, доступных при таком подходе, мы можем создать новые малые молекулы, которые будут иметь многообещающее применение в разработке лекарств».

Работа, таким образом, демонстрирует оптимизацию ресурсов для включения неканонических аминокислот в белки. Предложенный метод проще в применении, чем более ранние разработки, поскольку предполагает вмешательство только в один ген, а не в весь геном клетки. Кроме того, он расширяет спектр доступных неканонических аминокислот, поскольку четырехнуклеотидных кодонов больше, чем трехнуклеотидных.