CRISPR-инактивация ВИЧ, интегрированного в геном клеток, может вызывать протяженные делеции

Большинство препаратов современной антиретровирусной терапии блокируют размножение ВИЧ-1, однако после успешной обратной транскрипции и интеграции в геном ВИЧ-1 становится практически неуязвимым для терапии и создает потенциальный резервуар вируса в организме. В ряде исследований предпринималась попытка удалить вирусную ДНК из генома клетки с помощью системы CRISPR-Cas (см., например, публикацию 2019 года). Нуклеаза Cas вносит двуцепочечные разрывы по краям вирусной ДНК, которые репарируются по пути негомологичного соединения концов (NHEJ) и микрогомологичного соединения концов (MMEJ). В ходе такой репарации в районе интеграции вируса остаются мелкие инделы, инактивирующие его. Авторы нового исследования, опубликованного в Journal of Virology, показали, что после работы CRISPR-Cas в геномах клетках, инфицированных ВИЧ-1, могут появляться не только мелкие инделы, но и большие делеции, захватывающие фланкирующие вирус области. Эти делеции повышают риск злокачественной трансформации.

Ученые работали с T-клетками, происходящими от линии Jurkat, в геном которых был внедрен ВИЧ-1. Далее клетки трансдуцировали лентивирусными векторами, кодирующими Cas9 и гРНК, нацеленную на область перекрытия кодирующих областей вирусных генов Tat и Rev. Через две недели клеточная ДНК была проанализирована с помощью ПЦР и различных пар праймеров, перекрывающих разные участки вирусной ДНК и прилежащей клеточной ДНК. Оказалось, что в результате активности CRISPR-Cas9 в месте локализации ВИЧ и примыкающих последовательностей геномной ДНК образуется ряд протяженных делеций длиной в несколько тысяч пар оснований.

Результат подтвердился и при временной экспрессии Cas9 или Cas12 и гРНК в T-клетках SupT1, трансфицированных соответствующими векторам: в клетках появлялись протяженные делеции и за пределами ДНК ВИЧ-1. При этом во всех обнаруженных крупных делециях один из концов так или иначе попадал в ДНК ВИЧ-1 либо в прилежащую к нему область.

Чтобы ответить на вопрос, как именно могут появляться такие большие делеции, авторы работы проверили гипотезу о том, что внесение второго разрыва в клеточную геномную ДНК вне вирусной ДНК связано с неспецифической работой системы CRISPR-Cas. Однако анализ с помощью инструмента Cas-OFFinder для поиска участков, частично комплементарных гидовой РНК, показал, что проблема заключается не в неспецифической активности CRISPR-Cas. Дальнейшие исследования установили, что настоящая причина появления больших делеций —MMEJ в области разрыва.

Исследователи отметили, что появление столь крупных мутаций способны привести к делеции генов-супрессоров опухолей и активации онкогенов. Следовательно, применение CRSIPR-Cas для удаления ДНК ВИЧ-1 может повышать онкогенный потенциал клеток. По имеющимся данным, появление больших делеций вряд ли удастся предотвратить с помощью альтернативных Cas-нуклеаз или ингибиторов MMEJ. В настоящее время активны несколько клинических испытаний продукта компании Excision BioTherapeutics, исследующих возможность применения CRISPR-Cas для удаления ВИЧ-1 из генома пациентов. Эти испытания помогут ответить на вопрос о безопасности CRISPR-Cas-терапии при ВИЧ-инфекции.

Резервуаром ВИЧ в головном мозге оказалась микроглия