Нуклеаза Cas12a2 при активации разрывает геном клетки

Выборочное уничтожение клеток на основании их генотипа и состояния — важная биологическая и медицинская задача. Малые молекулы-ингибиторы, токсины, антитела, литические вирусы или программируемые иммунные клетки уничтожают клетки, в которых находятся специфические белки или работают какие-то сигнальные пути. Но эти методы не могут уничтожить клетки на основании других признаков, например, наличия мутации в некодирующей области генома.

Исследователи из Германии и США представили CRISPR-систему, способную выборочно уничтожать целевые клетки. Обычные CRISPR-системы не справляются с этой задачей, когда речь идет об эукариотических клетках. Так, Cas9 или Cas12a обычно вносят двухцепочечные разрывы ДНК, которые не ведут к гибели клетки, но активируют систему репарации, а Cas13a обычно уничтожает только целевой транскрипт.

Авторы ранее описали нуклеазу Cas12a2, которая при активации вносит множество двухцепочечных разрывов. В новой работе активность нуклеазы изучили на эукариотических клетках. Они выбрали два родственных варианта Cas12a2: один был получен из Sulfuricurvum sp. PC08-66 (SuCas12a2), а другой — из метагеномного образца (GeCas12a2). Последовательности двух ферментов совпадали на 89%.

Плазмиду, экспрессирующую GeCas12a2, перенесли в Saccharomyces cerevisiae. гидРНК была нацелена на транскрипт гена ADE2, не являющегося жизненно необходимым. Под влиянием GeCas12a2 количество дрожжевых клеток снизилось в 134 раза, FnCas12a — в четыре раза. В последнем случае срабатывала гомологичная рекомбинация.

Далее рибонуклеопротеиновый комплекс (РПК) GeCas12a2–гидРНК вносили в человеческие клетки методом электропорации. В первом случае это были клетки HeLa, экспрессирующие GFP, гидРНК таргетировала как раз транскрипт GFP. После электропорации клетки не пролиферировали, их даже становилось заметно меньше. Если рибонуклеопротеиновый комплекс не был ни на что нацелен или не обладал ферментативной активностью, клетки размножались как обычно.

Авторы выбрали в качестве мишеней шесть эндогенных транскриптов в четырех клеточных линиях, полученных из меланомы, рака легких и рака головы и шеи. Если транскрипт экспрессировался на низких уровнях, то количество клеток не снижалось. Эффект также зависел от концентрации РПК. Если все условия были соблюдены, GeCas12a2 и (в меньшей степени) SuCas12a2 снижали количество клеток. Cas12a2 можно было также упаковывать в липидные наночастицы.

Нуклеаза GeCas12a2, нацеленная на GFP или на GAPDH, повышала число двухцепочечных разрывов в геноме клетки в 5,2 раза по сравнению с контролями. Это было сравнимо с эффектом от цисплатина или этопозида. При этом GeCas12a2 была намного более избирательной. Под влиянием GeCas12a2 в клетках наблюдалась митотическая катастрофа и апоптоз. Однако, по-видимому, механизм клеточной гибели может быть и другим.

Авторы не нашли признаков того, что GeCas12a2 активируется, если ее мишень отсутствует в клетке (нецелевая активация). Они также проверили, не может ли какой-то собственный транскрипт клетки активировать нуклеазу. Один транскрипт, не полностью соответствующий последовательности гидРНК, умеренно активировал GeCas12a2 in vitro; он слабо экспрессировался в клетках HeLa и HEK293. Однако в опытах с клетками Cas12a2 был чувствителен к несоответствиям целевой последовательности и гидРНК — число клеток в этом случает не снижалось.

Исследователи проверили, может ли Cas12a2 уничтожать клетки, хронически зараженные вирусом, не затрагивая здоровые клетки. Для этого клетки заражали штаммами вируса папилломы человека высокого риска. гидРНК была нацелена на транскрипты, кодирующие онкопротеины E6 и E7. В результате 94% зараженных клеток погибало, в отличие от незараженных. Мышам имплантировали раковые клетки, зараженные вариантом 16 ВПЧ. Если доставить GeCas12a2 в опухоль с помощью липидных наночастиц, рост опухоли значительно замедляется.

Cas12a2 также можно использовать, чтобы обогатить культуру клетками, модифицированными с помощью генетического редактирования. В смешанной культуре Cas12a2 уничтожал целевые клетки, не повреждая окружающие, в которых не было мишени.

С помощью FnCas12a в ген GFP на хромосоме вносили делеции, эффективность редактирования составила примерно 11%. Затем в клетки вносили GeCas12a2, нацеленный на тот же сайт. В результате частота встречаемости делеции выросла в 3,1 раза. Тем же методом удалось повысить частоту встречаемости внесенных праймированным редактированием мутаций в 4,3 раза.

В третьем сценарии Cas12a2 распознавал РНК-мишени, связанные с заболеваниями. Авторы выбрали онкогенную мутацию KRAS^G12C в клетках NCI-H23. В результате 50% клеток погибли. Под действием препарата сорациба погибли 65% клеток, при совместном применении — 85%. Cas12a2 сохранял эффективность в клетках, резистентных к сорацибу.

По словам авторов, до использования Cas12a2 для терапии далеко. Например, неясно, как этот белок, даже неактивный, повлияет на организм. Проблемой остается и доставка Cas12a2 туда, где находятся целевые клетки.

Новая классификация систем CRISPR-Cas включает семь типов вместо шести