CRISPR-система для долговременного подавления экспрессии генов

Существует несколько систем на основе CRISPR, которые влияют на экспрессию генов. Для этого белок Cas без нуклеазной активности (dCas) сшивают с эффекторными доменами других белков. Однако такая система влияет на экспрессию до тех пор, пока она находится в физическом контакте с определенным локусом. Ученые из США создали конструкт для долговременного сайленсинга генов — dCas9-KAL. С белком Spy dCas сшили три домена от белков KRAB, DNMT3L и DNMT3A. Первый домен подавляет транскрипцию, а два других метилируют ДНК.

Сначала они создали стандартизированную репортерную клеточную линию для оценки эффективности конструктов. Клетки HEK293T трансдуцировали двумя лентивирусами, которые несли ген EGFP под конститутивным промотором SV40, а также гидРНК, нацеленную на SV40, и гены устойчивости к антибиотику пиромицину.

После этого клетки трансфецировали тремя конструктами — dCas9-KRAB, dCas9-DNMT3A и dCas9-DNMT3L. Для селекции использовали домен устойчивости к антибиотику зеоцину. Уровень флуоресценции измеряли с помощью проточной цитометрии.

Вскоре после трансфекции и селекции уровень флуоресценции значительно снизился. Со временем экспрессия EGFP восстановилась в части клеток. Однако существовала популяция клеток, в которых сайленсинг репортерного гена наблюдался в течение нескольких недель после трансфекции. Трансфекция отдельными конструктами была значительно менее эффективна.

В репортерном регионе клеток с подавленной экспрессией EGFP детектировали метилирование CpG-островков и гистоновую модификацию H3K9me3. Клетки удалось реактивировать с помощью конструктов с доменами белков TET1 и TET2, которые ускоряют деметилирование ДНК.

Ученые объединили все эффекторные домены в одном конструкте — dCas9-KAL (KRAB-DNMT3A-DNMT3L). Изменяя длину линкеров и последовательность промотора, удалось создать конструкт, который эффективно подавлял экспрессию репортерного гена. Конструкт dCas9-KL с доменами белков KRAB и DNMT3L также был достаточно эффективен.