Экспериментальная эволюция возбудителя туберкулеза открывает потенциальные механизмы устойчивости к новым препаратам

Журнал Antibiotics (Basel) опубликовал статью российских и болгарских ученых об исследовании in vitro механизмов устойчивости Mycobacterium tuberculosis к новым соединениям различных химических классов. Были получены спонтанные мутантные клоны, устойчивые к повышенным концентрациям новых производных ароилгидразонов и нитрофуроиламидов, разработанных болгарскими соавторами.

Соединения, использованные в исследовании: ароилгидразоны (Виолина Ангелова, Медицинский университет, София) и нитрофуроиламиды (Георги Добриков, Институт органической химии с Центром фитохимии БАН, София)

Любое значимое для микроорганизма изменение параметров окружающей среды приводит к запуску механизмов адаптации, в результате которых изменяются фенотипические свойства (скорости роста, внешнего вида колоний на питательной среде и др.) и генетические характеристики. В зависимости от длительности и интенсивности воздействия спонтанные мутации, дающие селективное преимущество для выживания и адаптации, закрепляются отбором. Культивирование бактерий на среде с активным соединением в повышенных концентрациях может выявить мутации, связанные с первичным ответом микроба и его устойчивостью, и позволяют получить представление о механизме действия соединения. Такие знания актуальны и для новых антибиотиков, и для соединений, которые еще находятся в процессе изучения.

Заболеваемость туберкулезом снижается, но те штаммы, которые выживают и циркулируют — всё в большей степени имеют множественную лекарственную устойчивость. Мы наблюдаем изумительную способность микробов находить способы ухода от действия даже антибиотиков нового поколения, например, бедаквилина, когда в процессе длительного и прерываемого лечения достаточно быстро возникают мутации мутации устойчивости. Таким образом, разработка новых препаратов остается необходимой. При этом уже на начальном этапе разработки желательно понимать возможный механизм формирования устойчивости, и анализ искусственно полученных устойчивых мутантов — наиболее быстрый способ.

«Ароилгидразоны содержат гидразоновую группу и отчасти подобны изониазиду, но имеют значительные перспективы в качестве противотуберкулезных препаратов из-за способности взаимодействовать с несколькими биологическими мишенями в клетке M. tuberculosis. Их механизмы действия включают ингибирование InhA, нарушение синтеза миколовой кислоты и клеточной стенки бактерий. В свою очередь, действие нитрофуранов основано на восстановлении нитрогруппы редуктазами. Основной известный механизм действия нитрофуранов, как показано на E. coli, основан на активации неактивного пролекарства нитрофурана нитроредуктазами, что далее приводит к окислительному стрессу», —отмечает соавтор работы Виолета Вылчева из Института микробиологии имени Стефана Ангелова Болгарской академии наук.

Интересно, что полученные клоны, устойчивые к десятикратным относительно МИК концентрациям ароилгидразонов, содержали как значимые несинонимичные замены, так и инактивирующие мутации сдвига рамки в различных существенных генах. При этом выявленные мутантные гены (ppgK, mmpS2, glpK, Rv3755c, spoU) не связаны сетью взаимодействий, то есть относятся к разным метаболическим путям.

Например, инактивирующая мутация (инсерция С в участке CCCCCC) в гене glpK была ранее описана как приводящая к образованию небольших колоний с медленным ростом, а также увеличению МИК к разным антибиотикам. Известно, что наряду с активацией эффлюксных насосов снижение скорости роста как раз и является одним из ключевых ответов M. tuberculosis на лекарственное давление. В другом устойчивом клоне была обнаружена мутация сдвига рамки в гене ppgK, который кодирует полифосфат-глюкокиназу. PpgK вероятно, связан с лекарственной толерантностью, вызванной голоданием, и с персистенцией M. tuberculosis у мышей. Интересно, что протеин PpgK расположен в сети белковых взаимодействий, включающей и крайне важный фактор инициации транскрипции SigA, с которым PpgK связан не только соседством на хромосоме, но и коэкспрессией. По мнению Игоря Мокроусова из Санкт-Петербургского института имени Пастера, «инактивация ppgK, вероятно, полезна для выживания микобактерий, поскольку она может гипотетически активировать более общую реакцию на стресс, косвенно приводя к толерантности».

 Сеть белковых взаимодействий, включающая PpgK.  https://string-db.org/network/83332.Rv2702

В клонах, устойчивых к нитрофуроиламидам, также были выявлены мутации в различных генах (nrdH, infB, Rv0224c, fbiC, iniA, Rv1592c, Rv1580c, Rv1639c), которые также не были связаны сетью белковых взаимодействий. Про некоторые из этих генов известно, что они участвуют в обеспечении лекарственной устойчивости или толерантности или в противодействии окислительному и нитрозативному стрессу.

По результатам изучения спонтанных устойчивых мутантов авторы исследования сделали общее заключение о том, что краткое (в течение месяца) действие in vitro на медленно растущие M. tuberculosis в основном ведет к появлению мутаций, которые противодействуют внешнему стрессу. Первичный ответ M. tuberculosis на селективное давление изучаемых соединений — сложный и многогранный. Он включает в себя множество неродственных генов и путей, связанных с неспецифическими механизмами толерантности (системы активного выброса, снижение скорости роста) или защитной реакцией на окислительный стресс.

Вячеслав Журавлев из Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии, не принимавший участия в исследовании, подчеркивает, что «на фоне высокой заболеваемости, вызванной устойчивыми штаммами M. tuberculosis, актуален поиск и тестирование новых кандидатных молекул. При этом описанный авторами подход к изучению новых соединений позволяет проводить их быстрый скрининг и формировать представление о механизмах адаптации M. tuberculosis. Выявленные закономерности сохраняют вероятность использования модификаций данных соединений в комплексной полихимиотерапии».

«Дальнейшее направление наших исследований — реализация длительного эксперимента для оценки не только первичной реакции микроба, но и ее возможных изменений на длительном промежутке времени», — отмечает Игорь Мокроусов

Работа российского коллектива была выполнена при поддержке РНФ (грант 24-44-00004, руководитель проекта — д.б.н. И.В. Мокроусов, Институт им. Пастера).