Генное редактирование против эпилепсии и нарушения цикла мочевины

Три статьи, опубликованные в новом номере Science Translational Medicine, описывают стратегии генного редактирования для лечения редких генетических заболеваний — форм эпилепсии, связанных с мутациями в гене SCN1A, а также цитруллинемии типа 1. Исследования выполнены на мышах, тем не менее они вызывают значительный интерес, поскольку одобренных методом лечения для этих состояний мало, а генное редактирование — однократное излечивающее вмешательство. В первой работе используется редактирование оснований, в двух других — прайм-редактирование.

Один из соруководитель первой работы — Дэвид Лю, директор Института трансформирующих технологий (Институт Бродов, МТИ, Гарвард), в лаборатории которого были созданы как редакторы оснований, так и прайм-редакторы. Эндрю Нельсон с коллегами использовали редактирование адениновых оснований для коррекции мутации в гене SCN1A, вызывающей синдром Драве. Это заболевание связано с мутациями в гене SCN1A, который кодирует альфа субъединицу натриевого канала Na_v 1.1 в нейронах. У больных развиваются когнитивные нарушения, высок риск летального исхода во время приступа.

Существуют разные подходы к патогенетической терапии болезней, связанных с мутациями в SCN1A, например, использование антисмыслового олигонуклеотида, увеличение экспрессии нормальной копии гена, генозаместительная терапия. Преимущество редактирования гена в том, что его регуляция остается естественной, и это снижает вероятность подобных эффектов.

Мишенью коррекции была нонсенс-мутация SCN1A^R613X, обнаруженная у части пациентов с синдромом Драве. Редактор аденинов при доставке в клетки человека и мышей продемонстрировал высокие показатели коррекции (72 и 92% соответственно). Было отмечено и нецелевое редактирование оснований, расположенных рядом с мишенью, но эти замены оценены авторами как непатогенные.

После этого систему протестировали на новорожденных мышатах, гетерозиготных по мутации SCN1A^R613X. Для доставки использовали векторы на основе аденоассоциированного вируса (ААВ). Поскольку редактирующая конструкция — белок Cas, слитый с редактором аденинов — слишком велика для упаковки в один вектор, ее ген доставлялся в двух ААВ, а затем в клетке фрагменты белка соединялись за счет интеинового транс-сплайсинга. Векторы вводили инъекционно в желудочки мозга.

Редактор оснований корректировал мутацию в ДНК и мРНК неокортекса на уровнях 59% и 97% соответственно. У мышат существенно снизилась частота судорог, как спонтанных (за сутки непрерывного видеонаблюдения на 22-й день жизни ни у одного из восьми мышат не случилось приступа), так и вызванных повышенной температурой. Выживаемость к 45-му дню выросла более чем в три раза. Когда редактирующую конструкцию ввели 12-дневным мышатам, у них тоже увеличилась втрое 60-дневная выживаемость по сравнению с плацебо, превысив 80%.

Причиной примерно 10% случаев синдрома Драве являются нонсенс-мутации с заменой аргининового кодона на стоп-кодон (CGA>TGA), в том числе вариант R613X. Все эти мутации могут быть исправлены с помощью редактирования оснований, отмечают авторы. Сейчас в базе данных ClinVar присутствует 1421 патогенный вариант SCN1A и 1465 вариантов неопределенной значимости, и все они короче 50 т.п.н., следовательно, могут быть исправлены редактором основанием или прайм-редактированием. Своевременно принятое решение о коррекции мутации у конкретного пациента может стать путем к здоровой жизни, как показывают результаты исследования.

Две другие работы были выполнены в Цюрихском университете (Швейцария). Авторы второй статьи, Лукас Кислинг и его коллеги, применили прайм-редактирование для исправления мутации в гене SCN1A, вызывающей генерализованную эпилепсию с фебрильными судорогами (GEFS+) — она похожа на синдром Драве, но имеет менее тяжелые симптомы.

Для доставки прайм-редактора в мозг новорожденных мышей также использовали два ААВ-вектора с последующей сборкой белка в клетке. Мишенью была мутация SCN1A^K1270T. Уровень отредактированной ДНК в коре мозга составил около 35%, мРНК — 81%. Выживаемость на протяжении 77 дней у гетерозиготных мышат достигла 100% (в контроле 80%), а частота судорог, индуцированных температурой, снизилась с 78% до 13%. Судороги при высокой температуре бывают и у 8% мышей дикого типа, отмечают авторы.

Наконец, Андраш Талас и его коллеги протестировали два разных метода доставки для прайм-редактирования с целью лечения цитруллинемии типа 1. Это редкое метаболического расстройство, нарушение цикла мочевины в печени, вызванное мутациями в гене аргининосукцинатсинтетазы 1 (ASS1). Единственным методом лечения остается трансплантация печени. Доставка редактирующей конструкции в печень — относительно простая задача, так как ее можно вводить внутривенно. Авторы использовали для доставки прайм-редакторов ААВ-векторы либо липидные наночастицы (ЛНЧ), содержащие РНК. Инъекции делали или новорожденным мышатам, или четырехнедельным, а в 24 недели исследовали уровни редактирования в печени и других органах.

Оба подхода восстановили функцию цикла мочевины. «Отредактированные» мыши нормально набирали вес, и никто из них не умер за период наблюдения, тогда как медианная продолжительность жизни контрольной группы составила около 12 недель. Однократное введение ААВ-векторов обеспечивало более высокие показатели коррекции в гепатоцитах по сравнению с ЛНЧ (в среднем 71% и 54% в группах лечения при рождении и в 4 недели соответственно.) В то же время доставка с помощью ЛНЧ делает возможным повторное введение, и это может быть лучшим вариантом для позднего начала терапии. Трехкратные инъекции с интервалом в пять дней улучшали результаты у четырехнедельных мышей (у новорожденных эффективность редактирования составила 24% после одной дозы, а у четырехмесячных она изначально была низкой, но после трех доз достигла 13%).

Авторы отмечают, что этот результат может иметь практические последствия для лечения любых генетических заболеваний, проявление которых может смягчить редактирование гепатоцитов.

Эти работы интересны возможностью сравнить преимущества и недостатки редакторов и методов доставки. Преимущество прайм-редактирования по сравнению с другими методами — высокая точность, как мы недавно писали. (Также на основе прайм-редактирования созданы методы замены очень протяженных участков ДНК, но в данных работах это было неактуально, так как мишенями были точечные мутации.) Прайм-редакторы не производят двухцепочечных разрывов, не задействуют механизм гомологичной рекомбинации и могут работать в неделящихся клетках, что особенно важно, если редактирование проводится не у новорожденных. Гепатоциты четырехнедельных мышей уже перестают активно делиться и могут ни разу не войти в митоз в те 2-3 дня, когда в клетках экспрессируется редактирующая конструкция после доставки в ЛНЧ. Аналогичные закономерности известны и для младенцев и взрослых людей.

Редактирование оснований, как и прайм-редактирование, не сопровождается внесением двухцепочечных разрывов, и оно позволяет достичь более высокого уровня редактирования. Клиническое применение персонализированного редактора оснований для коррекции гена CPS1 в клетках печени (случай Кей-Джея) стало сенсацией прошлого года. Но его возможности ограничены точечными мутациями, тогда как прайм-редактирование может исправлять и небольшие делеции/инсерции, и к тому же не затрагивает нецелевые нуклеотиды.

В отличие от доставки РНК в ЛНЧ, доставка гена в АВВ может привести к длительной экспрессии редактора в клетке, что вызывает опасения по поводу безопасности (нецелевой активности при высоких дозах, развитие иммунного ответа на ААВ)

Новый инструмент для редактирования ДНК с высокой точностью вставляет в геном целые гены