Мегануклеазы очищают нейроны от латентного вируса герпеса

При инфицировании вирусом простого герпеса (ВПГ) после острой фазы наступает латентная: вирус сохраняется в неактивном состоянии в сенсорных и автономных нейронах периферической нервной системы пожизненно с возможной реактивацией. В настоящее время методы лечения герпесвирусной инфекции нацелены на облегчение острых симптомов и снижение частоты рецидивов. Ученые из США и Франции разработали стратегию элиминации латентного ВПГ с помощью мегануклеаз, доставляемых в нейроны оптимизированным вектором на основе аденоассоциированного вируса (AAV), и протестировали ее на мышах.

Первый вариант этой стратегии был недостаточно эффективным. Мышам, инфицированным ВПГ-1, вводили самодополняющий вектор scAAV8, кодирующий мегануклеазу, специфичную к определенному гену вируса. (Серотип AAV8 был выбран из-за выраженного нейротропизма и относительно низкой способности трансдуцировать другие клетки.) Последующий анализ тройничных ганглиев мышей показал, что редактирование ДНК вируса в сайте-мишени происходило с частотой менее 4%. Значимого снижения вирусной нагрузки выявлено не было.

В новой работе авторы оптимизировали подход. Мышам с латентной инфекцией ВПГ-1 вводили вектор, кодирующий одну мегануклеазу, или два вектора, несущих мегануклеазы, специфичные к разным генам вируса. Анализ верхних шейных ганглиев (ВШГ) и тройничных ганглиев (ТГ) мышей месяц спустя показал, что одновременное использование двух мегануклеаз значительно эффективнее, чем одной. Вирусная нагрузка при такой терапии снижалась на 77–79% по сравнению с контролем. В оставшихся вирусных геномах уровень мутагенеза достигал 1% для одной мегануклеазы и 0,21% для второй.

В ходе дальнейшей оптимизации ученые проверили, как влияет серотип AAV на эффективность терапии. Различные серотипы демонстрируют тропизм к разным подтипам нейронов, поэтому авторы предположили, что наиболее действенным будет использование их комбинации. Эксперименты на мышах показали, что максимального снижения вирусной нагрузки можно добиться с помощью двух мегануклеаз, каждая из которых доставляется векторами трех серотипов (AAV1, AAV8 и AAVRh10). В этом случае нагрузка ВПГ-1 в ВШГ сокращалась на 92%, а в ТГ — на 54,8%.

Основываясь на полученных данных, авторы делают вывод, что единичные двухцепочечные разрывы в геноме ВПГ-1, как правило, восстанавливаются, и на их месте остаются мутации. При этом внесение двух разрывов с большой вероятностью приводит к деградации ДНК вируса.

Проверка влияния нового метода терапии на способность вируса к реактивации проводилась ex vivo на эксплантах ганглиев мышей с латентной инфекцией. Было показано, что в ганглиях мышей, получивших две мегануклеазы с вектором AAVRh10 количество геномов ВПГ-1, образовавшихся de novo, было снижено на 95% в ВШГ и на 55% в ТГ по сравнению с контролем.

Создание специфичных мегануклеаз более трудоемко, чем адаптация более популярной системы CRISPR-Cas9. Однако сравнение эффективности мегануклеаз и CRISPR-Cas9 на той же модели латентной инфекции ВПГ-1 говорит не в пользу последней: частота мутаций в геномах вируса после CRISPR-Cas9 настолько низка, что не распознавалась анализом T7E1 (мутации были подтверждены высокопроизводительным секвенированием). Возможно, дело в размерах белков: мегануклеаза значительно меньше CRISPR-системы, а потому ее проще доставить в нейрон.

В настоящее время ученые работают над аналогичной стратегией для терапии ВПГ-2. По их мнению, клинические испытания метода могут начаться не ранее, чем через три года.

«Мы сделали большой скачок от экспериментов в пробирках до экспериментов на животных, — говорит главный автор статьи доктор Кит Джером, профессор Отделения вакцин и инфекционных заболеваний Центра исследований рака Фреда Хатчинсона. — Я надеюсь, благодаря этому исследованию направление диалога вокруг исследований герпеса изменится, и мы начнем думать о лечении, а не только о том, как контролировать вирус».