Нарушение циркадного ритма может быть связано с фосфорилированием белка PER

Американские ученые обнаружили еще одну «деталь» внутриклеточных молекулярных часов. Открытие касается фосфорилирования одного из ключевых белков этого механизма, PER2.

Циркадные (околосуточные) ритмы у млекопитающих на молекулярном уровне регулирует система обратных связей транскрипции и трансляции ряда генов. Ключевую роль в этой системе играет гетеродимерный фактор транскрипции CLOCK:BMAL1, который усиливает экспрессию многих генов, управляющих суточными ритмами. Среди них есть и те, продукты которых способны репрессировать экспрессию самих белков CLOCK и BMAL1, — гены, кодирующие белки Period (PER) и криптохром (CRY). Белки PER служат основой комплекса с участием CRY и казеинкиназы 1 (CK1δ). Последняя связывается с димером CLOCK:BMAL1 и подавляет его активность. При этом по механизму обратной связи ингибируется транскрипция самих PER и CRY, и когда их количество снижается, CLOCK и BMAL1 дерепрессируются и цикл начинается заново.

Концентрации белков PER критически важны для циркадных ритмов и строго регулируется за счет транскрипционных, посттранскрипционных и посттрансляционных механизмов. Их постоянная оверэкспрессия нарушает циркадный ритм; с другой стороны, именно индуцибельная регуляция PER делает возможным возобновление перенастроенного суточного ритма, например, при джетлаге после перелета.

Стабильность белков PER1 и PER2 определяется активностью фермента CK1, который на протяжении всего цикла остается связанным с доменом CK1BD этих белков. Ранее было показано, что устойчивость PER2 регулируется по механизму «фосфопереключателя» (phosphoswitch): киназы фосфорилируют белок по конкурирующим сайтам, которые действуют альтернативно и определяют, быстро или медленно происходит деградация PER2.

Домен CK1BD содержит область FASP, богатую серинами, — именно их фосфорилирует CK1. Известно, что полиморфизмы в этой области гена Per2, приводящие к замене серина, нарушают фосфорилирование, в результате PER2 теряет стабильность и происходит укорочение циркадного ритма. Мутации в этой области приводят к развитию наследственной формы синдрома опережения фазы сна (familial advanced sleep phase syndrome, FASP, отсюда название участка белка). FASP проявляется преждевременными засыпанием и пробуждением; Кэрри Партч, руководитель работы, сравнила это состояние с «перманентным джетлагом».

В новом исследовании авторы установили, что фосфорилирование киназой CK1 сайтов PER, которое продлевает существование белка, приводит к ингибированию самой киназы по принципу обратной связи. Исследования проводили на клетках человека и дрозофилы.

Ранее те же авторы показали, что стабилизирующее фосфорилирование области FASP человеческого PER2 инициируется присоединением фосфата к первому из пяти остатков серинов в этой области, а затем киназа CK1 фосфорилирует остальные четыре серина. Оказалось, что и в этой реакции существует обратная связь. Активность фермента подавляется продуктом реакции, из-за чего процесс фосфорилирования замедляется.

В экспериментах in vitro ученые подтвердили, что фосфорилированные в области FASP пептиды инактивируют CK1 за счет прямого взаимодействия с ферментом. Как показали изучение кристаллической структуры комплекса фосфорилированной FASP с CK1 и симуляции молекулярной динамики, ключевую роль в этом играют консервативные сайты связывания анионов на CK1.

Далее авторы использовали клеточные линии U2OS, в которых белки PER1 и PER2 несли люминесцентные метки, и с помощью генного редактирования CRISPR/Cas внесли инделы в области FASP. Короткие делеции, удаляющие первый серин, нарушили фосфорилирование и привели к укорочению циркадного цикла.

Сходным образом, в клетках дрозофилы фосфорилирование домена PER-Short белка PER стабилизирует этот белок. Авторы показали, что это фосфорилирование ингибировало гомологичную киназу дрозофилы in vitro.

Таким образом, авторы описали механизм регуляции активности CK1, существующий как у позвоночных, так и у беспозвоночных. Фосфорилирование, которое стабилизирует PER, ингибирует фермент, осуществляющий фосфорилирование. Этот механизм позволяет управлять стабильностью и активностью киназы и более точно настраивать молекулярные часы клетки. Также становится понятным, что происходит при семейном синдроме опережения фазы сна: отсутствие фосфорилирования по FASP, стабилизирующего белок, активирует киназу, и фосфорилирование альтернативного участка ускоряет разрушение PER.

Управлять заживлением шрамов можно, блокируя ген циркадного ритма