«Натренированные» фаги уничтожили резистентную клебсиеллу

Антибиотикорезистентность возбудителей госпитальных инфекций продолжает расти, и одним из наиболее опасных микроорганизмов остается Klebsiella pneumoniae. Эта бактерия быстро приобретает ESBL (бета-лактамазы расширенного спектра действия) и карбапенемазы, что делает многие антибиотики неэффективными и существенно ограничивает терапевтические опции. На фоне кризиса применения антибиотиков вновь возрастает интерес к фаготерапии. Однако фаги имеют два крупных недостатка — узкий спектр активных штаммов и способность бактерий быстро развивать устойчивость. Ученые из США поставили задачу разобраться, можно ли расширить спектр хозяев фагов и повысить их способность подавлять клинические мультирезистентные (MDR) изоляты K. pneumoniae и изоляты с широкой лекарственной устойчивостью (XDR) при помощи направленной эволюции, используя длительное совместное культивирование фагов и бактерий.

Исследователи сформировали коллекцию из 11 фагов, выделенных из различных источников и относящихся к четырем филогенетическим кластерам. Морфологические отличия были подтверждены с помощью электронной микроскопии. Среди них встречались представители миовирусов, сифофагов и подовирусов. Спектр организмов-хозяев этих фагов первоначально протестировали на 59 клинических изолятах K. pneumoniae, включавших как чувствительные штаммы, так и многочисленные резистентные варианты. Выяснилось, что часть фагов обладает крайне ограниченной активностью, тогда как другие проявляют умеренную способность к лизису. Для дальнейших экспериментов были выбраны два фага со средней исходной эффективностью, Ace и APV, чтобы проверить, сможет ли эволюция действительно расширить их спектры.

Чтобы добиться адаптации, фаги ежедневно на протяжении 30 дней кокультивировали с клиническими штаммами K. pneumoniae. Это создавало постоянное эволюционное давление, заставляя фаги преодолевать защитные изменения бактерий. По завершении 30-дневного цикла исследователи выделили эволюционировавшие фаги и сравнили их с исходными по способности лизировать клинические изоляты. Спектр изолятов-хозяев значительно расширился: фаг APV, который изначально поражал около четверти изолятов, после эволюции начал лизировать до 60%. Фаг Ace, стартовавший с примерно 42%-ной эффективности, в двух из шести эволюционных линий достиг почти 60%-ной. При этом впервые появилась активность против тех филогенетических групп K. pneumoniae, для которых исходные фаги не показывали лизиса вовсе. Аналогичное расширение спектра наблюдали для штаммов с различными капсульными и О-антигенными типами.

Чтобы оценить, насколько это расширение соответствует реальному подавлению роста, авторы провели длительные (72 часа) тесты в жидкой культуре на чувствительных и на устойчивых штаммах. «Натренированные» фаги подавляли бактериальный рост значительно лучше, чем предковые формы. Для изолятов, не обладающих устойчивостью, улучшение наблюдалось примерно в 10 из 12 экспериментов. Для MDR и XDR-штаммов эффект оказался даже более выраженным: в каждом тесте тренированные фаги обеспечивали более эффективное и продолжительное подавление роста. В трех четвертях всех случаев подавление было статистически значимым.

Молекулярный анализ показал, что накопленные изменения были сосредоточены преимущественно в генах, кодирующих хвостовые фибриллы и элементы базальной пластинки фага, — именно те структуры, которые отвечают за распознавание и прикрепление к бактериальной клетке. У всех «тренированных» вариантов была как минимум одна аминокислотная замена в L-образной хвостовой фибрилле, то есть адаптация проходила за счет изменения механизмов связывания с клеточной поверхностью. Эти данные объясняют наблюдаемое расширение спектра хозяев.

Таким образом, авторы показали, что всего за 30 дней возможно существенно изменить свойства фагов и усилить их активность против MDR и XDR изолятов K. pneumoniae. Экспериментальная эволюция не только расширила спектры хозяев, но и усилила способность фагов подавлять бактериальный рост на протяжении длительного времени, что важно для клинического применения.

Обнаружен общий механизм, позволяющий фагам сосуществовать на одних штаммах бактерий