Новый способ доставки CRISPR-Cas12a в клетки проверили на мышах

Система CRISPR-Cas12a уже показала себя как эффективный инструмент редактирования генома и успешно применяется в фундаментальных исследованиях. Однако для внедрения CRISPR-Cas12a в медицинскую практику необходимо решить ряд задач, одна из которых — выбор оптимального способа доставки. Вирусные векторы, которые обычно используются в качестве носителей компонентов системы, имеют ряд ограничений, в числе которых потенциальная иммуногенность, нежелательный инсерционный мутагенез и другие. В новой работе ученые из США предложили способ невирусной доставки рибонуклеопротеинового (RNP) комплекса Cas12a/crRNA в клетки.

В качестве носителя RNP они выбрали так называемые наноклубки ДНК (DNA nanoclew). Связывание наноклубков с RNP происходит за счет комплементарности ДНК и crRNA; этот комплекс представляет собой ядро системы доставки. Полученная структура покрывается слоем катионного полимера полиэтиленимина, за счет чего происходит конденсация отрицательно заряженного ядра. Сверху наносится слой анионного полимера, способного менять заряд в зависимости от кислотности среды: в физиологических условиях комплекс приобретает отрицательный заряд, в кислотных — положительный. Именно это свойство обеспечивает биосовместимость системы: упакованный таким образом комплекс RNP с наноклубком ДНК не распадается в кровеносной системе, сохраняя отрицательный заряд. При захвате же комплекса клеткой-мишенью заряд меняется на отрицательный в кислотной среде эндосомы, в результате чего RNP высвобождается. К Cas12a подшит сигнал ядерной локализации, поэтому RNP проникает в клеточное ядро, где и происходит распознавание и редактирование таргетного участка генома.

Эффективность системы доставки проверили in vitro и in vivo, выключая с ее помощью ген Pcsk9 в гепатоцитах. Продукт этого гена, пептидаза PCSK9, участвует в метаболизме холестерина. Фармакологическое ингибирование PCSK9 применяется как метод снижения уровня холестерина в крови, поэтому регуляция экспрессии Pcsk9 может иметь терапевтическое значение. Для доставки RNP в клетки конкретного типа ученые конъюгировали внешний полимерный слой с галактозой, которая связывается с асиалогликопротеиновым рецептором на поверхности гепатоцитов.

Во время экспериментов на культурах клеток ученые использовали crRNA, комплементарную разным экзонам Pcsk9. Оптимальной оказалась crRNA, связывающаяся с экзоном 3 (crRNA-exon3) — ее использование приводило к инделам в 75% клеток, поэтому именно этот вариант был выбран для дальнейших опытах на мышах.

Мышам вводили комплекс Cas12a/crRNA-exon3, связанный с наноклубками ДНК и заключенный в полимерную оболочку, внутривенно, три раза: на первый, третий и пятый день эксперимента. Через неделю после третьей инъекции собирали для анализа образцы крови и ткани печени. Уровень PCSK9 у мышей сократился на 88%, концентрация холестерина в сыворотке крови уменьшилась на 45%. По данным глубокого секвенирования гена-мишени, частота инделов составила 48%. Анализ биомаркеров крови не выявил признаков гепатотоксичности комплекса.

Авторы считают, что предложенная система доставки Cas12a/crRNA может лечь в основу новой платформы, адаптируемой для различных типов клеток и генов-мишеней.