PARADISCO — новый метод обнаружения ингибиторов транспортных белков, ассоциированных с раком

Переносчики растворенных веществ (SLC) — большая группа мембранных белков, отвечающих за транспорт аминокислот, сахаров и других соединений в клетку и выведение их наружу. С помощью таких белков транспортируется в том числе лактат — конечный продукт гликолиза, который продуцируют в большом количестве раковые опухоли. Лактат способен подавлять иммунные клетки и вызывать резистентность к лечению. Транспортеры лактата (всего их описано четыре) играют в этом ключевую роль, однако эти белки еще недостаточно изучены. В Центре молекулярной медицины Академии наук Австрии (CeMM) разработали новый метод изучения белков-переносчиков и с помощью этого метода нашли новый селективный ингибитор.

Лактат преимущественно переносится через мембрану белками семейства SLC16. Главная сложность при изучении белков SLC заключается в их функциональной избыточности — одну и ту же функцию выполняют несколько паралогов. Они различаются по характеру экспрессии в клетках и тканях, так, SLC16A1 экспрессируется повсеместно, а SLC16A8 — исключительно в ткани сетчатки. Большое структурное сходство между ними затрудняет разработку селективных ингибиторов.

Авторы обратили внимание на синтетическую летальность между переносчиками лактата SLC16A1 и SLC16A3 (жизнеспособность клеток снижает лишь потеря функции обоих транспортеров из-за ингибирования или мутации, но не какого-то одного из них). Используя этот принцип, они создали скрининговую систему, которую назвали паралогозависимым изогенным клеточным анализом (PARADISO). Система включает пять изогенных клеточных линий, причем выживание и приспособленность каждой из них зависит от разных паралогов. Четыре линии экспрессируют по одному индивидуальному переносчику, пятая, контрольная, — все четыре.

Исследование проводилось на гаплоидной линии клеток человека HAP1. Клетки, не экспрессирующие SLC16A3, становятся чувствительными к ингибированию SLC16A1, в то время как в клетках, экспрессирующих SLC16A3, этот белок берет на себя функцию ингибированного SLC16A1, и такие клетки выживают. Авторы решили создать клеточные линии, каждая из которых зависит от одного из переносчиков лактата. Так, клеточная линия, экспрессирующая только SLC16A1, будет чувствительна к ингибиторам SLC16A1, но не к селективным ингибиторам SLC16A3, SLC16A7 или SLC16A8.

На первом этапе были созданы две клеточные линии: одна не экспрессировала SLC16A1, другая не экспрессировала SLC16A3. На них и контрольной линии дикого типа тестировали различные ингибиторы белков-переносчиков лактата, например сиросингопсин — ингибитор с высоким сродством к SLC16A3. Полученные данные о сродстве ингибиторов к переносчикам соответствовали предыдущим исследованиям.

Как показало РНК-секвенирование, клетки HAP1 изначально не экспрессируют ни SLC16A7, ни SLC16A8. Чтобы создать еще двае изогенные клеточные линии, зависимые от от этих двух паралогов, авторы сначала добились сверхэкспрессии каждого из них в клетках, которые экспрессировали только SLC16A1, а затем нокаутировали в них ген SLC16A1. В результате были получены четыре линии, в каждой из которых работал только один транспортер.

Авторы провели скрининг библиотеки, содержащей примерно 90 тысяч соединений, чтобы найти селективные ингибиторы SLC16A3. Из 1410 соединений, снижающих жизнеспособность клеток на 50% по сравнению с ДМСО, отобрали вещества, способные уничтожать клетки, зависимые от функции SLC16A3, но не клетки дикого типа и не зависимые от SLC16A1; таких веществ оказалось 34. Дальнейший скрининг на других клеточных линиях позволил выбрать 13 веществ с еще более высокой селективностью к SLC16A3. При обработке клеток этими соединениями в них накапливался лактат.

Затем авторы проверили метаболическую стабильность соединений в микросомах печени. Было отобрано одно из них, названное slCeMM1, которое ингибировало рост клеток, зависящих от SLC16A3 (но не клеток, зависящих от SLC16A1), и вызывало накопление внутриклеточного лактата. Протеомный анализ методом масс-спектрометрии подтвердил высокую селективность соединения.

Подобный подход может быть применен и к другим белкам-мишеням, имеющим паралоги, отмечают авторы.

Новый метод высокопроизводительного скрининга лекарств