Праймеры для ДНК-баркодинга чужеродных рыб в Волге

В естественных условиях расселение животных лимитируется их радиусом индивидуальной активности, и для большинства видов этот радиус относительно невелик. Гидробионты для расселения используют водные пути. Деятельность человека сильно влияет на перемещения гидробионтов, способствуя биологическим инвазиям.

Команда ученых из Института биологии внутренних вод РАН и Института проблем экологии и эволюции РАН оптимизировали метод идентификации чужеродных видов рыб в реках Волге и Каме. Работа опубликована в Water.

Река Волга была вовлечена в колоссальную программу гидростроительства. На Волге устроены девять крупных водохранилищ. Кама пострадала меньше — на ней всего три крупных водохранилища. Это закономерно отражается в доле чужеродных видов: в настоящее время доля чужеродных видов рыб в водохранилищах Волги составляет от 8% до 32%, для водохранилищ Камы она составляет 2–16%.

Чужеродные виды могут нарушить равновесие экосистемы, поэтому одна из ключевых задач при мониторинге биологических инвазий — быстрая и точная идентификация вселенца. Лучше всего для решения этой задачи подходят методы ДНК-идентификации.

Для видового определения рыб используется ДНК-баркодинг по участку митохондриального гена цитохромоксидазы (COI). Этот ген консервативен, что позволяет использовать универсальные праймеры для большого числа близкородственных видов. Однако чем выше универсальность, тем ниже специфичность, поэтому все большую популярность приобретает моделирование праймеров, нацеленных на конкретные группы животных. Авторы новой работы пошли именно по этому пути. Они разработали набор праймеров, позволяющих эффективно идентифицировать вселенцев в Волго-Камском бассейне. При разработке ученые опирались на последовательности, загруженные в базу NCBI GenBank.

Для локуса COI они предложили праймеры, обеспечивающие более эффективную амплификацию как стандартного фрагмента для ДНК-баркодинга, так и более короткого фрагмента мтДНК. Это позволяет проводить идентификацию фрагментарных и сильно деградировавших проб, а также работать с так называемой природной ДНК (eDNA), содержащейся в воде. Однако работа только с одним локусом может приводить к ошибкам. Для повышения точности идентификации ученые разработали дополнительный набор праймеров, нацеленных на последовательности большой субъединицы митохондриальной (16S) и малой субъединицы ядерной (18S) рибосомальной ДНК.

Праймеры протестировали на образцах чужеродных рыб, выловленных в Волго-Камском бассейне в летние сезоны 2005–2020 гг. Было получено 146 последовательностей локуса COI, 77 последовательностей локуса 16S и 91 последовательность для 18S. На основе этих последовательностей ученые проследили генетическую изменчивость 31 вида пресноводных рыб. Кроме того, была сформирована референсная библиотека, содержащая последовательности практически всех чужеродных рыб региона, а также были подтверждены находки нескольких новых видов.

В рамках исследования также были оптимизированы протоколы выделения ДНК, проведения ПЦР и очистки ПЦР-продукта. Новые версии протоколов позволяют использовать самые распространенные пластик, реактивы и оборудование. Стоимость одного сиквенса после оптимизации составила менее $2.

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки РФ и гранта РФФИ.