PrimalSeq для исследования геномов патогенов во время вспышки

Распространение человеческого вируса оспы обезьян в 2022 году, на фоне еще не оконченной пандемии COVID-19, еще раз напомнило о важности современных методов эпиднадзора, в частности, секвенирования геномов. Оспа обезьян — зоонозная болезнь, эндемичная для Западной и Центральной Африки. Вирус включает три клады, I, IIa, and IIb; человеческий вирус оспы обезьян (ВОЗ рекомендовала для него название «мпокс» — он распространяется грызунами, а не приматами, к тому же упоминание обезьян дискриминирует пациентов) относится к субкладе IIb. На 5 января 2023 года было зарегистрировано 84 075 случаев инфекции в 103 неэндемичных странах. Авторы статьи, опубликованной в PLoS Biology, предлагают альтернативу метагеномному секвенированию для исследования геномов вируса мпокс.

Метагеномные подходы применялись в начале вспышки мпокс, но они требуют значительных затрат и относительно высоких концентраций вирусной ДНК в образце. Метод, который рассматривают авторы, — высокомультиплексное секвенирование, основанное на ампликонах (highly multiplexed amplicon-based sequencing, PrimalSeq). Он стал основным подходом к секвенированию SARS-CoV-2, но разработан был для вируса Зика еще в 2017 году, с тем, чтобы использовать в полевых условиях или малобюджетных лабораториях. Протокол включает онлайн-инструмент Primal Scheme для создания праймеров, таргетное обогащение с помощью мультиплексной ПЦР, оптимизированные методы подготовки библиотеки как для нанопоровых секвенаторов Oxford Nanopore Technologies (разработчики рассчитывали на MinION), так и для инструментов Illumina, а также биоинформатический пайплайн для получения консенсусной последовательности. Обогащение оказалось достаточно эффективным даже для образцов, содержащих 50 копий генома на реакцию, консенсусные последовательности можно было получить за 1-2 дня; метод успешно использовался для изучения распространения вируса Зика в Америке.

Авторы новой статьи использовали Primal Scheme, чтобы подобрать праймеры для секвенирования генома человеческого вируса оспы обезьян. Схема включала 163 пар праймеров с длиной ампликонов 1597–2497 п.н. (средняя длина 1977 п.н.). Эта схема совместима с протоколами, которые начали применяться в лабораториях общественного здравоохранения во время пандемии COVID-19.

Чтобы оценить эффективность протокола, авторы исследовали образцы, положительные по вирусу мпокс (в основном мазки из кожных поражений, а также из ротоглотки), с помощью метагеномного секвенирования и PrimalSeq. Оказалось, что второй метод обеспечивает более высокое покрытие, а потери ампликонов минимальны; преимущества особенно очевидны при высоких значениях Ct (то есть при малых количествах целевой ДНК). Чтобы максимизировать покрытие в условиях ограниченных ресурсов, авторы рекомендуют выбирать образцы с Ct менее 31 и стремиться генерировать не менее миллиона прочтений на образец.

Авторы отправили свои праймеры в 10 лабораторий общественного здравоохранения США, Великобритании, Бразилии и Португалии. Эти лаборатории успешно интегрировали схему праймеров человеческого вируса оспы обезьян в различные рабочие процессы секвенирования ампликонов (как на платформах Illumina, так и на Oxford Nanopore) и с различными типами образцов.

Таким образом, PrimalSeq может быть более чувствительной, дешевой и производительной альтернативу метагеномному секвенированию для исследования геномов человеческого вируса оспы обезьян.

Получены первые геномы вирусов оспы обезьян, вызвавших новую вспышку