Проанализированы различные активаторы транскрипции на основе CRISPR-системы

Одно из актуальных приложений CRISPR-технологий — регуляция экспрессии генов. В этом случае ученые используют мутантный белок dCas9, лишенный нуклеазной активности, но сшитый с эффекторным доменом. Связываясь с областью промотора или энхансера, такая конструкция активирует транскрипцию гена.

Существует множество работ, где используются такие инструменты, но по-прежнему не хватает исследований по их всестороннему сравнению. Ученые из университета Райса (США) сравнили пять эффекторных доменов (dCas9-VPR, dCas9-SAM, dCas9-SunTag, dCas9-p300 и dCas9-CBP) в трех клеточных линиях (HEK, HeLa и K562). Их конструкции были нацелены как на промоторную область, так и на область энхансера.

Авторы обнаружили, что экспрессия dCa9-VPR, dCas9-SunTag, dCas9-p300 и dCas9-CBP была сильно снижена во всех клеточных линиях по сравнению с dCas9. Тем не менее конструкции работали, а dCa9-VPR эффективно активировал транскрипцию генов даже после уменьшения количества вводимой плазмиды. В целом результаты эксперимента демонстрируют, что активация экспрессии зависит от конструкции dCas9, типа клеток и активируемого локуса. Вместе с тем ученые заметили, что взаимодействие с промотором более эффективно запускает экспрессию, чем с взаимодействие с энхансером.

Несмотря на эти результаты, стратегия нацеливания на энхансер также была успешной. Ученые продемонстрировали, что активаторы транскрипции на основе dCas9 могут индуцировать локальный синтез РНК, когда они нацелены на энхансеры. Более того, синтез некодирующей РНК с энхансерной области положительно коррелирует с активацией мРНК с помощью соответствующего нижележащего промотора.

Авторы изучили влияние CRISPR-технологий на гистоновые метки. Они сконцентрировались на ацетилировании лизина в 27 положении гистона H3 (H3K27ac), который маркирует активные регуляторные элементы. Ученые обнаружили, что то, какая платформа наиболее эффективно меняет эпигенетический профиль локусов, зависит от типа клеток. В то время как в HeLa все протестированные активаторы успешно индуцировали появление метки H3K27ac, в клетках HEK конструкции dCas9-VPR и dCas9-SunTag не вызывали значительных изменений в локальном уровне этой метки.

Интересно, что эпигенетические изменения в энхансере коррелировали с таковыми в промоторной области, однако обратной связи не наблюдалось. Тем не менее, авторы нашли взаимную связь между синтезом целевой мРНК и наличием метки H3K27ac в области энхансера.

С помощью специального метода секвенирования 3C (chromosome conformation capture) ученые оценили контакты между областью промотора и энхансера после активации. Они обнаружили, что после активации энхансера плотность контактов этой области с промотором увеличивается. Целенаправленная активация промотора не приводила к подобным изменениям.

Таким образом, исследователи провели полномасштабное сравнение различных CRISPR-технология для регуляции экспрессии генов. Они продемонстрировали, что на эффективность экспрессии влияет как линия клеток, так и локус, таргетируемый dCas9. Ученые также обнаружили обратную связь между экспрессией мРНК и активностью энхансерной области. Их исследование подчеркивает важность правильного выбора клеточной линии, активируемого локуса и конструкции dCas9-эффекторный домен.