Протеаза L5 определят антимикробные свойства везикул бактерии Lysobacter sp. XL1

Грамотрицательные бактерии образуют везикулы внешней мембраны (outer membrane vesicles, OMV), вмещающие важные факторы взаимодействия с внеклеточной средой. Так, OMV бактерии Lysobacter sp. XL1 содержат бактериолитическую протеазу L5, что дает везикулам способность уничтожать микробные клетки. Команда ученых из Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук определили роль этой протеазы в биогенезе везикул.

Бактериолитические ферменты — перспективная альтернатива антибиотикам в борьбе с резистентными бактериями. Работу по выделению литических бактерий в ИБФМ РАН инициировал академик Георгий Скрябин. В 1975 г. группа Вероники Ламбиной выделила из реки Оки штамм Lysobacter sp. XL1, а член-корр. РАН Игорь Кулаев возглавил изучение биохимии и литического потенциала бактерии. В 2000-х гг. под руководством д.б.н. Ольги Степной были выделены пять бактериолитических ферментов Lysobacter sp. XL1, в том числе протеаза L5. В настоящее время исследования продолжаются; действующий лидер команды — к.б.н. Наталья Леонтьевская.

Ранее эта команда показала, что L5 локализуется в периплазме внутреннего листка внешней мембраны. Именно из этой части мембраны формируются OMV, содержащие L5. Ученые предположили, что L5 вовлечена в биогенез OMV. На первом этапе проверки гипотезы они экспрессировали ген alpB, кодирующий протеазу лизобактера, в филогенетически близкой бактерии Pseudomonas fluorescens Q2-87/B. Модифицированная P. fluorescens производила больше везикул по сравнению с исходным штаммом, и в этих везикулах присутствовала L5. Таким образом было получено косвенное подтверждение предположения. В новом исследовании ученые работали непосредственно с Lysobacter sp. XL1. Они изучили биогенез OMV у штамма, лишенного функционального alpB.

Чтобы выключить alpB, Lysobacter sp. XL1 трансформировали плазмидой, несущей кассету с делеционным вариантом гена. «Несмотря на то, что род Lysobacter был сформирован еще в 1978 году и к настоящему времени известно более 50 видов этих бактерий, представители рода плохо изучены, а методическая база для проведения молекулярно-генетических исследований незначительна», — рассказывает первый автор работы Ирина Кудрякова, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории биохимии клеточной поверхности микроорганизмов ИБФМ РАН. Команде пришлось оптимизировать условия трансформации Lysobacter sp. XL1 и культивирования полученных мутантов.

Делецию в итоговом штамме Lysobacter sp. XL1ΔalpB::tet подтведили с помощью ПЦР и секвенирования. Мутантная бактерия росла в стандартной среде так же хорошо, как и исходный штамм, то есть отсутствие alpB не влияет на физиологию лизобактера. При этом мутантный штамм производил меньше везикул, чем Lysobacter sp. XL1 дикого типа.

Электронно-микроскопическое исследование показало, что нокаут alpB изменяет также соотношение пустых и наполненных OMV. Исходный штамм давал в два раза больше полных везикул, чем пустых. У мутантного штамма же отношение полных OMV к пустым было равно 0,7. Эксперименты с культурами грамположительных бактерий (стафилококков, микрококков и бацилл) показали, что выключение alpB приводит к практически полной потере бактериолитической активности OMV. Полученные результаты подтверждают участие протеазы L5 в биогенезе везикул у Lysobacter sp. XL1. В дальнейшем авторы планируют изучить соответствующий молекулярный механизм.

По словам Ирины Кудряковой, в настоящее время антибактериальные свойства протеазы L5 тестируются in vitro и на модельных инфекциях у мышей. Lysobacter sp. XL1 синтезирует не только протеазу L5. Бактерия выделяет во внешнюю среду целый комплекс литических ферментов, что делает ее активным участником природных биоценозов и перспективным продуцентом новых антимикробных препаратов.

«Мы выделяем новые бактериолитические ферменты из разных представителей Lysobacter, конструируем на их основе антимикробные препараты и проводим анализ их эффективности совместно с нашими коллегами из Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии, — говорит Кудрякова. — Внешнемембранные везикулы Lysobacter sp. XL1 — хорошая модель для конструирования антимикробных препаратов. Была показана их эффективность против сибирской язвы и стафилококкового сепсиса».