Редактирование отдельных нуклеотидов эффективно при серповидноклеточной анемии

Серповидноклеточная анемия (SCD) и бета-талассемия являются наследственными заболеваниями, вызванными мутациями в гене HBB, кодирующим бета-гобин — субъединицу взрослого гемоглобина. Оба заболевания проявляются после рождения, когда происходит переключение экспрессии с содержащегося в фетальном гемоглобине (HbF) γ-глобина на мутантный β-глобин. Ранние работы показали, что подавление экспрессии BCL11A — ингибитора HbF — при помощи Cas9-систем позволяет возобновить экспрессию HbF и снизить проявления SCD и бета-талассемии. В новой статье ученые из США и Австралии показали, что редактирование отдельных нуклеотидов позволяет более эффективно восстановить экспрессию HbF в сравнении с Cas9-системами.

Авторы использовали CD34⁺ гемопоэтические стволовые клетки, полученные от здоровых доноров. Методом электропорации в клетки вносили белок-редактор ABE7.10 и гидовую РНК, направленные на создание новых сайтов связывания активаторов транскрипции KLF1 (мутация -198A>G; числом обозначено расстояние от сайта начала транскрипции γ-глобина), TAL1 (-175A>G) или GATA1 (-113A>G). Также были протестированы Cas9-системы, таргетирующие GATA1-мотив в энхансере BCL11A или сайт связывания BCL11A в промоторе γ-глобулина.

Частоты отредактированных нуклеотидов на третий день после индуцированной дифференциации клеток в эритроциты составили 12%, 35% и 22% для позиций -198, -175 и -113 соответственно. Частота отредактированных сайтов при использовании Cas9 составила 90% и 83% для энхансера BCL11A и сайта его связывания в промоторе γ-глобина соответственно. Доля клеток, экспрессировавших HpF, повысилась при всех методах редактирования. При этом отношение процента HpF-положительных клеток в популяции к проценту отредактированных сайтов было выше при редактировании отдельных нуклеотидов, чем при использовании Cas9-систем. Наибольшую эффективность показала замена -175A>G. При этом редактирование отдельных нуклеотидов, в отличие от Cas9, не вызывало активации системы контроля повреждений ДНК, выраженной в экспрессии CDKN1.

Мутация -175A>G создает сайт связывания транскрипционного фактора TAL1 в 9 пн от сайта связывания GATA1. Совместно эти два белка провоцируют связывание белков LMO2 и LBD1, которые опосредывают дистанционное взаимодействие β-подобных глобиновых генов и энхансера.

Дальнейшие опыты с получением колоний отредактированных эритроцитов показали, что частоты отредактированных сайтов при использовании ABE7.10 значительно ниже, чем при использовании Cas9. Однако уровни HbF при использовании ABE7.10 показывали четкую зависимость (R²=0,8) от процента отредактированных сайтов. В то же время при использовании Cas9 наблюдался большой разброс в уровнях HbF в колониях, несмотря на то что процент отредактированных сайтов в них был близок к 100%.

Авторы также сравнили эффективность ABE7.10 с другим белком-редактором ABE8e. Последний показал большую эффективность редактирования в целевом сайте (56% против 36%), однако это сопровождалось большим количеством побочных мутаций. Тем не менее, негативные эффекты последних на экспрессию HbF не перевешивали преимуществ от большей эффективности редактирования.

Наконец, авторы провели эксперименты по имплантации модифицированных стволовых клеток мышам. Доля фетальных эритроцитов в популяции после имплантации составила 64% и 73% при использовании ABE7.10 и ABE8e соответственно (6% у контролей). При этом все еще наблюдалась зависимость уровня HbF от процента клеток, несущих отредактированные сайты. Авторы изолировали незрелые эритроциты от мышей с SCD, получавших отредактированные CD34⁺ клетки, и инкубировали их в среде с 2% кислорода. Процент серповидных клеток после инкубации составил 40% против 73% в контрольной группе, не получавшей модифицированные клетки.

Таким образом, работа продемонстрировала, что редактирование отдельных нуклеотидов является более эффективным и стабильным методом для восстановления экспрессии HbF по сравнению с Cas9.

Рецептор CD201 — маркер хорошо приживающихся гемопоэтических клеток