Редактор оснований исправил мутацию, вызывающую редкое сосудистое заболевание

Синдром мультисистемной дисфункции гладких мышц (multisystemic smooth muscle dysfunction syndrome, MSMDS) — крайне редкое наследственное заболевание, которое вызывается миссенс-мутациями гена ACTA2, приводящими к замене аргинина в положении 179. Наиболее часто при данном заболевании встречается замена аргинина на гистидин, вызванная мутацией G>A. Ген ACTA2 кодирует альфа-актин 2 — необходимый компонент гладкомышечных волокон. Мутации в этом гене ассоциированы с потерей сократительной способности гладкомышечных клеток. Так как эти клетки находятся не только в стенках кровеносных сосудов, но и в легких, стенках кишечника и мочевого пузыря, мышцах глаз, нарушения при этом синдроме затрагивают разные физиологические функции.

Среди наиболее опасных проявлений MSMDS — аневризмы и диссекции аорты, стеноз церебральных артерий, аневризма аорты, нарушение функции сосудов мозга и гематоэнцефалического барьера. Это существенно увеличивает риск инсультов в течение первого десятилетия жизни человека. В настоящее время для пациентов с MSMDS не существует доступных методов лечения. Ученые и врачи из Гарвардской медицинской школы, Детской исследовательской больницы св. Иуды и Центра геномной медицины Массачусетской больницы общего профиля предложили терапевтический подход, основанный на редактировании ДНК, и испытали его на мышиной модели заболевания. Статья об этом опубликована в Nature Biomedical Engineering.

Для исправления мутации авторы работы выбрали редакторы адениновых оснований (ABE), способные выполнить обратную замену A>G. Редакторы оснований, в отличие от других систем CRISPR-Cas9, не делают двунитевых разрывов в ДНК и не вырезают ее фрагмент, а изменяют азотистое основание в составе нуклеотида, таким образом заменяя одну «букву» на другую. Как правило, редакторы основания содержат нуклеазу Cas9 Streptococcus pyogenes (SpCas9), слитую с доменом нуклеотиддезаминазы, а направляющая РНК обеспечивает редактирование только в определенном участке генома.

Главный недостаток CRISPR-систем, испытанных в более ранних исследованиях, заключался в нецелевых заменах нуклеотидов. В частности, при использовании SpCas9 дикого типа происходила также замена соседней аминокислоты в положении 178, нарушающая функцию актина, что неприемлемо для лечения людей.

Исследователи провели скрининг различных вариантов систем CRISPR-SpCas9 на клетках в культуре, содержащих целевую мутацию. Они варьировали последовательности направляющих РНК, а также использовали модифицированный фермент SpCas9 с заменой четырех аминокислот (SpCas9-VRQR). С этим ферментом им удалось достичь высокого уровня редактирования целевого нуклеотида при минимальном нецелевом. Для дополнительного повышения точности авторы с помощью белковой инженерии сконструировали фермент с еще одной заменой аминокислоты, который обозначили как SpCas9-eVRQR.

Новую конструкцию испытали in vivo на специально созданной линии мышей, моделирующих MSMDS. Модель воспроизводила ключевые фенотипы заболевания человека — мыши умирали в раннем возрасте от тяжелых сосудистых патологий. Дополнительные симптомы включали расширение зрачков, гидронефроз и расширение мочевого пузыря и кишечника.

Для доставки терапевтической конструкции в организм использовали векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV); из-за большого размера кодирующей конструкцию последовательности ее разделили на две части и доставляли в двух векторах. Авторы испытали два разных серотипа вируса — AAV9, который в основном трансдуцирует нейроны и астроциты, и недавно разработанный ими AAV-PR с улучшенной трансдукцией клеток сосудов.

Генотерапевтические конструкции вводили мышатам внутривенно и через 7–8 недель анализировали геномы из образцов разных тканей, чтобы оценить уровень коррекции. Наиболее высокого уровня исправлений удалось достичь в печени (до 60%), сердце (до 22%), сосудистой системе мозга (до 23%) и аорте (<3%). При этом доставка в AAV-PR обеспечила более высокий уровень редактирования, чем AAV9, во всех тканях, особенно в сосудах мозга.

Наконец, авторы оценили состояние мышей через 8 недель после инъекции. Все мыши, получившие генную терапию, были живы к этому моменту, тогда как все контрольные модельные мыши умерли. Терапия увеличила продолжительность жизни животных в несколько раз (медианная выживаемость более 22 недель, максимальная — до 44-х). У мышей после лечение улучшилось состояние головного мозга и аорты, смягчились другие симптомы MSMDS. Некоторую пользу принесло и лечение в более позднем возрасте, хотя у новорожденных мышат оно было более эффективным.

«История этого исследования началась буквально у постели больного, — говорит соруководитель исследования Патрисия Мусолино из Массачусетской больницы общего профиля. — Нашу команду, в которую входят специалисты по клиническим, генетическим, биологическим и терапевтическим аспектам этого заболевания, впервые собрал младенец в критическом состоянии. Теперь у нас есть четкий план действий по возвращению в стационар с экспериментальным препаратом».

В этом исследовании также участвовал Бенджамин Кляйнстивер с коллегами из Центра геномной медицины Массачусетской больницы общего профиля. Именно они разработали персонализированный CRISPR-Cas9 редактор оснований, который помог спасти жизнь младенцу, родившемуся с тяжелым заболеванием обмена веществ (подробнее на PCR.NEWS).

Предложенный подход, по мнению авторов, может помочь и в разработке генной терапии других заболеваний сосудистой системы.

Генная терапия на основе CRISPR-Cas9 впервые получила разрешение на использование