Регенерирующие нейроны нематоды изолировали с помощью фемтосекундного лазера

Регенерация нервной ткани — привлекательная тема исследований, а популярный модельный объект — нематода Caenorhabditis elegans. Этот модельный организм отличается простым устройством нервной системы: взрослая гермафродитная особь (у C. elegans два пола — самцы и гермафродиты) имеет всего 302 нейрона. А прозрачное тело червя позволяет наблюдать за регенерацией аксонов с помощью флуоресцентного микроскопа.

Влияние тех или иных генов на регенерацию нервной системы нематоды исследуется путем получения мутантных особей. Понимание механизмов регенерации может улучшить РНК-секвенирование единичных нейронов, но нейроны со специфическими регенеративными фенотипами довольно сложно изолировать и при этом не вызвать повреждения или деградации.

Исследователи из США предложили для этого метод фемтосекундной лазерной микродиссекции (fs-LM) — вырезание клеток непосредственно из живой ткани с микрометровой точностью. В качестве показателя структурной целостности клетки использовали цитоплазматический зеленый флуоресцентный белок GFP (собирали только клетки, которые сохраняли уровень флуоресцентного сигнала). Удалось успешно выделить нейроны с флуоресцентной меткой даже из головного ганглия. Но немеченые клетки с характерным фенотипом, в том числе редкие, метод также позволяет изолировать.

Авторы убедились, что вырезание сомы (тела) нейрона с помощью fs-LM обеспечивает чувствительное и специфическое профилирование экспрессии генов методом секвенирования РНК единичных клеток (scRNA-seq). При этом по сравнению с другими методами изоляции клеток, например FACS, смягчаются транскрипционные артефакты, связанные со стрессом, который вызывается диссоциацией ткани. Метод также улучшает воспроизводимость секвенирования РНК и облегчает профилирование динамики транскрипции.

Так, scRNA-seq регенерирующих нейронов, изолированных fs-LM, обнаружила программы транскрипции, которые коррелируют с успешной регенераций у нематод дикого типа и с неудачной — у нематод с нокаутом гена dlk-1.

Чтобы исследовать индивидуальную изменчивость клеток, авторы выделили одиночные регенерирующие нейроны, принадлежащие к одному типу, но отличающиеся по скорости отрастания аксонов, и нашли генные модули с паттернами экспрессии, которые коррелировали со скоростью роста.

Таким образом, fs-LM — перспективный метод выделения отдельных клеток. Среди минусов авторы упоминают высокую трудоемкость и низкую пропускную способность, что делает метод более подходящим для прецизионных и ориентированных на фенотип исследований. Пропускная способность может быть увеличена с помощью автоматизации.