Система на основе CRISPR распознает мутации без амплификации ДНК

В настоящее время золотыми стандартами для распознавания однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) являются ДНК-чипы, генотипирование с помощью зондов TaqMan и секвенирование нового поколения. Для всех этих методов требуются амплификация ДНК и сложные оптические приборы. Иными словами, эти методы невозможно применять вне лаборатории. Ученые из Литвы и США разработали новый метод детекции SNP, который не требует амплификации ДНК или оптических измерений, и испытали его на мутациях, связанных с серповидноклеточной анемией (СКА) или боковым амиотрофическим склерозом (БАС).

Ранее эта группа уже представила технологию на основе графенового полевого транзистора (gFET), которая позволяет распознавать таргетный ген в образце неамплифицированной геномной ДНК. В новой работе создали и испытали gFET-систему на основе технологии CRISPR — CRISPR-SNP-Chip, или SNP-Chip.

Деактивированный фермент Cas, не разрезающий ДНК, ковалентно прикрепляли к поверхности графена. Cas образовывал комплекс с гидРНК, созданной специально, чтобы таргетировать локусы с СКА- или БАС-связанными SNP. Образец ДНК инкубировали на графене, и если таргетная последовательность полностью соответствовала гидРНК, то она закреплялась на поверхности, но если соответствие было неполным, то и связь была слабее. После этого gFET промывали, и непрочно связанные молекулы ДНК с SNP удалялись с поверхности графена. Электрические сигналы от gFET распознавались с помощью компьютера.

Сначала технологию опробовали на гене HBB, мутации в котором отвечают за СКА. Получили ДНК от здорового человека с двумя аллелями HbA и от пациента с двумя аллелями HbS (мутация E6V). Создали две гидРНК, таргетировавшие аллели HbA и HbS. Сначала использовали амплифицированные регионы с HbA и HbS, при этом система SNP-Chip могла различить образцы от здорового человека и от пациента. После этого процесс успешно повторили на образцах неамплифицированной геномной ДНК. Концентрации таргетной ДНК при этом могут быть совсем небольшими (не более 6,3 фемтомолей).

Далее технологию проверили на пациенте с наследственным боковым амиотрофическим склерозом (мутация H44R в гене SOD1). Для этого использовали человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC), полученные от здорового человека и от пациента с БАС. Система SNP-Chip успешно распознавала эту мутацию как при амплификации таргетного участка, так в неамплифицированной геномной ДНК.

В системе SNP-Chip также можно применять другой фермент Cas9 с нуклеазной активностью от Streptococcus pyogenes или ортолог Cas9 от Mycoplasma gallisepticum, штамм CA06 (MgaCas9), который использует другой вид гидРНК. Когда исследовали возможность SNP-Chip распознавать гетерозиготу с аллелями HbA и HbS, система с деактивированным Cas9 не могла различить гетерозиготу и гомозиготу по мутантному аллелю, однако системе с MgaCas9 это удалось.

Недавно появилась технология лечения СКА и БАС с помощью генной терапии, основанной на CRISPR. Для применения такой терапии на людях необходимо провести большую работу по дизайну и оптимизации CRISPR. Система SNP-Chip может помочь не только в диагностике заболеваний, но и в оптимизации комплекса CRISPR для редактирования генома человека. Хорошие результаты диагностики означают, что такая CRISPR-система перспективна и для генной терапии.