Трансплантированные мышам клетки щитовидной железы вырабатывают тиреоглобулин

Врожденный гипотиреоз, или дефицит гормонов щитовидной железы, — достаточно распространенная патология (встречается у 1 из 3500 новорожденных). Также недостаток этих гормонов испытывают пациенты, перенесшие операцию по частичному или полному удалению щитовидной железы. Оба состояния требуют пожизненной заместительной терапии тиреоидными гормонами. Другим перспективным способом помочь таким людям может стать клеточная терапия. Из собственных клеток пациента получают индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), которые дифференцируют в функциональные фолликулярные клетки щитовидной железы, при необходимости «дорабатывают» их с помощью генного редактирования и трансплантируют пациенту.

Технология получения функциональных клеток щитовидной железы из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) или ИПСК с дальнейшей трансплантацией и восстановлением гормонального фона уже неплохо отработана на мышах. Однако для человека до сих пор применялась лишь альтернативная стратегия получения клеток щитовидной железы за счет оверэкспрессии экзогенных PAX8 и NKX2-1. Поэтому следующим шагом на пути к разработке клеточной терапии и ее применению в клинике должен стать способ получения функциональных клеток щитовидной железы без применения трансгенов. Продолжая собственные исследования в этой области, коллектив ученых из Бостонского медицинского центра и коллабораторы разработали протокол дифференцировки ИПСК для получения большого количества функциональных клеток щитовидной железы из различных линий ИПСК человека.

Сначала ученые взяли линию ИПСК человека, в которой один из маркеров клеток щитовидной железы NKX2-1 уже был связан с репортерным флуоресцентным белком GFP, и с помощью CRISPR-системы пометили второй отличительный ген этих клеток PAX8 другим репортерным флуоресцентным белком tdTomato. В результате получилась бифлуоресцентная линия ИПСК, в которой можно одновременно визуализировать экспрессию двух специфичных для клеток щитовидной железы маркеров NKX2-1 и PAX8.

Первые попытки дифференцировать эти ИПСК в клетки щитовидной железы по разработанному в лаборатории протоколу не увенчались успехом, о чем свидетельствовал крайне низкий процент меченных клеток при культивировании как в 2D условиях, так и в 3D-культуре. Оптимизировав протокол, ученым удалось значительно повысить эффективность дифференцировки. Совместная экспрессия GFP и tdTomato впервые отмечалась на 10-й день, а к 14-му дню около 35% клеток демонстрировали колокализацию флуоресцентных сигналов. Результаты ПЦР на 12-й день дифференцировки подтвердили, что только популяция клеток, одновременно несущих GFP и tdTomato, экспрессирует комбинацию уникальных маркеров клеток щитовидной железы NKX2-1, PAX8, HHEX и FOXE1. Пользуясь тем же протоколом дифференцировки, ученые получили клетки щитовидной железы, определяемые по NKX2-1 и PAX8, из других линий ИПСК и ЭСК человека.

Секвенирование РНК единичных клеток и анализ UMAP показали, что BMP4, один из основных факторов и компонентов среды для дифференцировки в клетки щитовидной железы, поддерживает клетки-предшественники щитовидной железы, но предотвращает их созревание. Отмена BMP4 после спецификации линии способствовала образованию зрелых клеток щитовидной железы, которые составляли большую часть клеточной массы на протяжении месяца. Авторы также определили поверхностные маркеры, которые могли бы облегчить выделение клеток-предшественников щитовидной железы в отдельную популяцию.

Добившись с помощью оптимизации условий культивирования достаточной эффективности дифференцировки клеток щитовидной железы, ученые перешли к экспериментам in vivo. Атимическим мышам с нефункциональной иммунной системой и искусственно вызванным гипотиреозом под капсулу почки вводили полученные из ИПСК клетки, около 67% и 54% из которых были положительны одновременно по NKX2-1 и PAX8 на 30-й и 47-й день дифференцировки соответственно. Через 12 недель трансплантированные клетки сформировали экспрессирующие NKX2-1 фолликулоподобные эпителиальные структуры, в просвет которых начал секретироваться тиреоглобулин. При этом не наблюдалось образования тератом или других опухолей. К сожалению, несмотря на развитие сосудистой сети, трансплантаты не секретировали T4 и не смогли нормализовать уровни тиреотропного гормона и Т4 в крови мышей.

Тем не менее, в ходе исследования авторы создали репортерную линию ИПСК человека, с помощью которой можно отслеживать, количественно оценивать и выделять клетки, экспрессирующие специфичные для фолликулярных эпителиальных клеток щитовидной железы маркеры NKX2-1 и PAX. Был оптимизирован протокол дифференцировки этих клеток с учетом особенностей различных стадий, что позволило значительно повысить ее эффективность. По мнению авторов, работа стала важным этапом на пути создания клеточной терапии гипотиреоза.

Женщина с диабетом не нуждается в инсулине после трансплантации островков из ее собственных клеток