CRISPR-систему успешно использовали для снижения холестерина у макак-крабоедов

Ген PCSK9 давно рассматривали в качестве цели для генетической модификации. Он экспрессируется главным образом в печени. Мутации, приводящие к оверэкспрессии PCSK9, вызывают гиперхолестеринемию у человека. Более низкий уровень экспрессии, в свою очередь, снижает уровень холестерина, связанного с липопротеинами низкой плотности (холестерин-ЛПНП), в крови и уменьшает риск атеросклероза. Ученые из США и Канады использовали редактор аденина на основе CRISPR-системы, чтобы внести однонуклеотидную замену в ген PCSK9 макаки-крабоеда и снизить уровни PCSK9 и холестерина-ЛПНП в крови животного. Недавно такого же результата добилась другая команда исследователей, однако они модифицировали этот ген без использования CRISPR-системы.

Сначала систему опробовали in vitro. Редактор аденина на основе CRISPR-системы ABE8.8 заменяет A на G и может инактивировать гены, внося изменения в сайты сплайсинга. В отличие от Cas9 и Cas12, ABE8.8 не вносит двухцепочечные разрывы в цепь ДНК. Чтобы доставить в первичные гепатоциты человека мРНК ABE8.8 и несколько видов гидРНК, ученые использовали липидные наночастицы. Отобрали гидРНК с наилучшими показателями, которая таргетирует сайт сплайсинга на границе экзона 1 и интрона 1. Частота редактирования была больше 60%, экспрессия PCSK9 снизилась на 55%.

Далее редактировали ген Pcsk9 у мышей. Липидные наночастицы с мРНК ABE8.8 и гидРНК вводили внутривенно. Через неделю частота редактирования всех клеток печени достигала 70%, то есть, скорее всего, были отредактированы все гепатоциты.

На последнем этапе проверили эффективность системы на макаках-крабоедах. В пилотном кратковременном исследовании 1 мг/кг наночастиц вводили внутривенно. Через две недели частота редактирования составила в среднем 63%; в 0,5% случаев были отмечены инделы. Уровень белка PCSK9 в крови макак снизился на 81%, а уровень холестерина-ЛПНП — на 65%. Через 24 часа после введения наночастиц частота редактирования составляла 48%. Редактирование последовательности гена PCSK9 происходило в основном в печени, намного реже в селезенке и в надпочечниках.

Во втором кратковременном исследовании ученые показали, что через две недели при всех дозировках — 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг и 1,5 мг/кг — достигается частота редактирования выше 50%. Уровни аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы кратковременно возросли, но через две недели пришли в норму. Токсичности для печени и для всего организма выявлено не было. Уровень мРНК ABE8.8 в печени быстро снизился в течение 48 часов и практически не определялся через неделю.

В долгосрочном исследовании использовали бóльшую дозу — 3,0 мг/кг. Частота редактирования в печени через две недели составила 66%, частота инделов — 0,2%. Уровень белка PCSK9 в крови макак снизился на 90% и оставался постоянным в течение восьми месяцев. Уровни холестерина-ЛПНП и липопротеина (а) снизились на 60% и 35%, соответственно, и также оставались стабильными в течение восьми месяцев. Реакции на редактирование со стороны иммунной системы макаки отмечено не было.

Нецелевое редактирование в печени было отмечено в одном сайте, и даже в нем не превышало 1% при дозах 1,0 мг/кг и 1,5 мг/кг. При дозе 0,5 мг/кг нецелевого редактирования не обнаружили. Тем не менее, авторы исследования считают, что переходить к клиническим испытаниям преждевременно.