Повысить эффективность генного редактирования можно, воздействуя на клетки-продуценты вектора

Для некоторых видов терапии, например, генной терапии, необходимо наладить доставку макромолекул в различные клетки в культуре и организме. Для доставки часто используют вирусоподобные частицы, в том числе модифицированные (engineered virus-like particles, eVLP), которые сочетают преимущества вирусных и невирусных методов доставки. Ученые постоянно улучшают eVLP, например, увеличивая размер их груза или количество вырабатываемых человеческой клеткой-продуцентом eVLP. Однако ранее изменяли именно свойства частиц, а не клеток. Исследователи из США изменили сами клетки-продуценты Gesicle 293T.

Авторы использовали полногеномный скрининг, чтобы выявить, какие изменения в геноме клетки-продуцента повлияют на выработку eVLP. Изменения вносили Cas9 и гидРНК. Эта гидРНК потом паковалась в частицы, и по ее количеству можно было оценить эффект генетического вмешательства на выработку и упаковку eVLP.

Клетки-продуценты трансдуцировали лентивирусной библиотекой из 98 077 уникальных гидРНК, таргетирующих 19 707 генов человеческого генома. Каждый вектор включал инструкции для производства Cas9. Также в клетки помещали плазмиду, кодирующую компоненты редактора адениновых оснований (ABE)-eVLP.

После выработки eVLP авторы изолировали РНК из частиц и оценили количество гидРНК. Секвенируя спейсер, можно выяснить, какой ген был затронут. Оказалось, что в большинстве случаев нокаут генов никак не влиял на выработку или полезную нагрузку eVLP, иногда снижал и очень редко повышал.

Сильнее всего снижали выработку или загрузку eVLP нокауты генов MPP8, TASOR и MORC. Все они связаны с HUSH-комплексом, отвечающим за эпигенетическое подавление экспрессии генов без интронов, включая ретровирусные элементы. Количество гидРНК снижалось в 1,5–3,8 раза. Схожие результаты показали на клетках HEK293T.

Авторы предположили, что эти гены влияют на выработку или загрузку eVLP, модулируя экспрессию Cas9. Действительно, при нокауте HUSH-генов экспрессия мРНК Cas9 выросла в 5,4–29 раз, а белка — в 10–14 раз. Вероятно, обычно HUSH-гены подавляют экспрессию Cas9, но при их нокауте избыток Cas9 конкурирует за связывание с гидРНК и мешает их упаковке в eVLP. Однако в некоторых условиях подавление экспрессии HUSH-генов может даже улучшать доставку груза eVLP.

С другой стороны, подавление экспрессии MAF1, репрессора транскрипции РНК-полимеразы III, изначально положительно влияло на выработку или загрузку eVLP. Все гидРНК экспрессируются с промотора РНК-полимеразы III — U6. Вероятно, нокаут MAF1 в клетках-продуцентах повышает уровень транскрипции гидРНК и улучшает ее загрузку в eVLP.

Авторы предположили, что ABE-eVLP, вырабатываемые клетками-продуцентами с нокаутом MAF1 будут лучше доставлять груз в целевые клетки. Действительно, v4 ABE-eVLP лучше доставляли груз, который приводил к модификации локусов GAPDH и HIRA в клетках HEK293T, а v5 ABE-eVLP лучше доставляли груз в клетки Neuro-2a. Более того, в опытах на мышах v5 ABE-eVLP, вырабатываемые клетками с нокаутом MAF1, редактировали 19,4% оснований в локусе Pcsk9 в клетках печени, а вырабатываемые обычными клетками-продуцентами — только 12,6%. Схожий результат был получен на клетках HEK293T/17, с другим грузом для eVLP и даже с другими частицами.

Исследователи в будущем планируют не просто отключать гены, но и вносить другие изменения в работу клетки, чтобы выявить, как это повлияет на производство частиц.

Обнаружена маленькая и активная нуклеаза для редактирования генома человека