Российские ученые исследовали влияние вариантов гена SCN1A, ассоциированного с эпилепсиями, на сплайсинг

Многие моногенные наследственные заболевания связаны с нарушением сплайсинга. Золотой стандарт исследования таких нарушений — ОТ-ПЦР образцов пациента, однако далеко не всегда есть возможность провести подобное исследование. Альтернативой могут быть сплайсинговые репортерные системы минигенных конструкций: векторы, содержащие экзоны в различных геномных контекстах и под различными промоторами. Такие системы позволяют изучать влияние на сплайсинг различных факторов, в том числе однонуклеотидных полиморфизмов.

Белковый продукт гена SCN1A — альфа-субъединица натриевого канала Na_V1.1. Мутации в этом белке являются наиболее частой причиной моногенной эпилепсии. SCN1A экспрессируется преимущественно в ингибиторных нейронах коры. Известно, что мутации утраты или приобретения функции Na_V1.1 тесно связаны с выраженностью симптомов эпилепсии и других неврологических расстройств. Мутации Na_V1.1, передающиеся по наследству, лежат в основе синдрома Драве (редкой пожизненной формы эпилепсии с ранним началом). Десять процентов белковых продуктов гена SCN1A образуются в результате альтернативного сплайсинга, причем некоторые данные указывают на то, что информация о сплайсинговых вариантах сильно неполна. Ученые из московского Медико-генетического научного центра провели большую работу, чтобы восполнить этот пробел: создали репортерную систему для изучения сплайсинга в гене SCN1A и исследовали с ее помощью почти сотню вариантов. Результаты опубликованы в журнале Brain.

Исследователи проанализировали все известные однонуклеотидные полиморфизмы в гене SCN1A и показали, что у этого гена есть множество сплайсинговых вариантов и сотни неаннотированных полиморфизмов, которые могут оказывать влияние на сплайсинг. Затем с помощью мутагенеза in silico они предсказали сплайсинговые варианты в экзонах, большинство которых не встречалось у пациентов. Чтобы проверить эти предсказания, была создана репортерная система, которая включала 18 векторов, покрывающих все 26 экзонов SCN1A. Для оптимизации системы исследователи применили ряд новых подходов, в частности, открыли важные цис-регуляторные элементы, уменьшили силу промотора плазмиды.

С помощью этой системы авторы работы изучили, как выявленные ими варианты могут влиять на сплайсинг. Проанализировали 95 вариантов SCN1A, в том числе 68 описанных в литературе интронных вариантов, расположенных за пределами канонических сайтов сплайсинга, 21 экзонный вариант (среди них были как синонимичные, так и миссенсы, нонсенс и делеция без сдвига рамки считывания), а также шесть вариантов, описанных у пациентов.

Поиск патогенных вариантов у больного — важная практическая задача. Авторы обратились к базе данных компании «Геномед», выполняющей более тысячи различных генетических тестов. В исследование включили результаты 17 249 NGS-тестов, включавших анализ SCN1A, и с помощью сервиса «Феномед» отобрали семь экзонных и шесть интронных вариантов; среди них для функционального анализа было выбрано шесть новых (три экзонных и три интронных). Пять из этих новых вариантов, обнаруженных у российских пациентов, действительно влияли на сплайсинг белка.

На вопросы PCR.NEWS ответил руководитель работы к.б.н. Михаил Скоблов, заведующий лабораторией функциональной геномики ФГБНУ «Медико-генетический научный центр».

Феномен влияния кодирующих и некодирующих вариантов гена на сплайсинг описан для других генов? Если да, то для каких?

Да, конечно, кодирующие и некодирующие варианты могут влиять на сплайсинг всех генов, у которых есть экзон-интронная структура, и мы в лаборатории проводим функциональные исследования таких вариантов. Как у нас устроена подобная работа? К нам в лабораторию обращаются врачи-генетики или же коллеги, которые занимаются ДНК-диагностикой, с просьбой оценить влияние найденного варианта у пациента с наследственным заболеванием. Если ген экспрессируется в доступных для взятия тканях, то мы проводим исследования в нативном материале, и для этого у нас в МГНЦ сейчас функционирует прекрасный биобанк клеточных культур пациентов. Если экспрессия гена происходит в труднодоступных для взятия биопсии тканях или же сам пациент не доступен, то в этих случаях единственной альтернативой является проведение экспериментов в системе минигенов in vitro, которые мы разрабатываем в лаборатории.

А дальше так: генов много, заболеваний много, и вариантов сплайсинга, которые находят у пациентов, тоже много. Поэтому такие исследования мы проводим довольно активно, и они очень востребованы как для ответов на вопросы врача-генетика, так и для дальнейшей научной публикации полученных результатов.

Планируете ли вы провести аналогичный анализ для других генов, ассоциированных с эпилепсией или другими заболеваниями?

Для более частых наследственных заболеваний у нас может накапливаться много запросов для проведение подобных исследований, и тогда мы решаем разработать системы для всего гена, позволяющие проводить функциональные анализы любых вариантов сплайсинга. На сегодняшний день у нас есть хорошие рабочие системы для гена PAX6 (врожденная аниридия), DMD (миодистрофия Дюшенна–Беккера), SCN1A (синдром Драве), COL2A1 (COL2A1-ассоциированные скелетные дисплазии). В процессе разработки система для гена CFTR (муковисцидоз).

Российские ученые описали новый вариант наследственной миопатии