Сканирование ДНК искусственными нанопорами повысит точность анализа

Биологические нанопоры успешно применяются для секвенирования ДНК и даже пептидов. На этом, например, основана технология секвенирования Oxford Nanopore — в ходе такого секвенирования молекулу ДНК протягивают через закрепленную в мембране белковую пору. Однако в современных системах присутствуют факторы, которые снижают точность секвенирования — невозможно точно контролировать, какая именно молекула считывается в данный момент и с какой скоростью она проходит через нанопору. Для решения этой проблемы уже пытались разрабатывать нанопоры из неорганических материалов, включая стеклянные нанопоры, называемые нанокапиллярами. До сих пор такие системы сталкивались с тем же набором проблем, что и биологические варианты. В новой работе, опубликованной в Nature Nanotechnology, представлен метод, позволяющий добиться высокой степени пространственного контроля при пропускании молекул через стеклянную нанопору.

Новый подход построен на основе сканирующей микроскопии с ионной проводимостью. Анализируемые молекулы закрепляются на стеклянной поверхности. Для контроля точных движений зонда микроскопа, в котором закреплен нанокапилляр, используется высокоточный пьезоконтроллер. Зонд медленно приближается к молекуле и, как пипетка, засасывает ее внутрь по принципу электрофореза. Далее нанокапилляр начинает удаляться от поверхности, «ощупывая» молекулу и считывая изменения в проводимости. В результате получается график зависимости проводимости от расстояния по вертикальной оси (направленной вверх от стеклянной поверхности). Авторы назвали метод сканирующей спектроскопией с ионной проводимостью (scanning ion conductance spectroscopy; SICS). В пробном испытании с помощью SICS была успешно считана позиция dCas9 комплекса, связанного с ДНК.

SICS обладает рядом преимуществ перед традиционными технологиями, использующими нанопоры. Так, закрепление анализируемой молекулы на поверхности позволяет точно контролировать скорость считывания, регулируя скорость движения зонда-нанопоры. За счет этого результат анализа можно представить как график проводимости от пройденного расстояния, а не проводимости от времени, и значительно повысить точность считывания. Для подтверждения этого авторы использовали ДНК-линейки — молекулы ДНК, на которых через равные промежутки расположены состоящие из шпилек маркеры. С помощью SICS они добились высоких точностей считывания расстояний между маркерами — разброс считанных расстояний составил 1 % при измерении SICS и 30 % без контроля скорости. Возможность снижать скорость считывания в такой системе позволяет уменьшить отношения сигнала к шуму (в проведенном опыте — на порядок, в сравнении с отсутствием контроля скорости).

Также нанокапилляр может свободно двигаться по трем осям, что обеспечивает сразу несколько преимуществ нового метода. Во-первых, становится возможным многократно считывать одну и ту же молекулу или даже один конкретный участок молекулы, что дополнительно увеличивает точность. Так, использование множества измерений повысило соотношение сигнал/шум в 20 раз по сравнению с однократным прочтением. Во-вторых, предложенная система обеспечивает возможность мультиплексного анализа. SICS позволяет закрепить на поверхности большое количество молекул и считать их, при этом точно известно, какое прочтение относится к какой молекуле. В ходе испытаний нового метода авторы успешно идентифицировали четыре различных конструкта ДНК, содержащих одноцепочечные участки разных размеров.

Наконец, SICS обладает высокой чувствительностью — авторам удалось успешно считать однонуклеотидные разрывы (участки, где в двуцепочечной структуре недостает отдельного нуклеотида в одной из цепей) и отличить такие фрагменты ДНК от целостных молекул.

Авторы считают, что SICS открывает новые возможности в целом ряде областей — от решения диагностических задач до использования ДНК в качестве хранилища данных. Однако метод все еще обладает рядом недостатков, включая сложность стандартизированного производства нанокапилляров. При этом, как отмечают авторы, спектр молекул, которые можно считать при помощи SICS, определяется только возможностью закрепления их на субстрате.