Анализ мембранных белков поможет в разработке иммунотерапии опухолей

Данных о протеоме, транскриптоме и геноме опухолевых клеток недостаточно для поиска белков-мишеней лекарственных препаратов. Если молекула не представлена на мембране клетки, она будет недоступна для лекарств. Некоторые лекарства используют мембранные белки как челнок для достижения своей истинной мишени, поэтому необходима информация об интернализации белков, т. е. об их эндосомальном транспорте.

Команда ученых из Швеции предложила и проверила новый метод, который позволяет анализировать совокупность белков цитоплазматической мембраны (ученые предлагают термин «сурфасеом», англ. surfaceome) и все белки эндосом (эндоцитом). Новая технология получила название TS-MAP. Для анализа полученных данных они разработали классификатор SURFME. С его помощью определяли типы мембранных белков.

Суть метода TS-MAP состоит в следующем: с помощью специального агента к внеклеточным аминногруппам мембранных белков присоединяется биотин, после чего образцы отправляют на масс-спектрометрию. Полученные данные фильтруют и по биотиновой метке определяют белки, которые находились в цитоплазматической мембране. При анализе эндоцитома клетки, обработанные биотинилирующим агентом, инкубируют некоторое время до образования эндосом с включенными в них биотинилированными белками. После этого удаляется биотин с белков, оставшихся в цитоплазматической мембране. Таким образом, во время анализа данных масс-спектрометрии биотином будут помечены только эндосомальные белки. Для валидации протокола исследователи использовали вестерн-блоттинг и конфокальную флуоресцентную микроскопию.

Ученые проверили новую технологию на первичных культурах клеток глиобластомы. Они сравнили сурфасеом и эндоцитом клеток для 2D- и 3D-культуры опухоли. Применив TS-MAP, ученые расклассифицировали мембранные белки с помощью программы SURFME. При создании программы они вручную собрали информацию о белках цитоплазаматической мембраны из баз данных UniProt, SwissProt и GeneOnthology. Кроме того, для подготовки данных они использовали литературу, размещенную на PubMed и GeneCards. Новый классификатор содержит данные о 3 317 белках.

Сравнив 2D- и 3D-культуры опухолевых клеток, ученые обнаружили, что в обоих случаях белки-резиденты цитоплазматической мембраны в основном содержат одну трансмембарнную спираль. При этом в объемной культуре было повышено содержание интегринов, протеогликанов и семафоринов, которые отвественны за правильную организацию межклеточного матрикса и межклеточного взаимодействия. Также в 3D-культуре присутствовали мембранные белки, экспрессия которых активируется гипоксией. Это согласуется с тем фактом, что внутри опухоли существует зона с малым содержанием кислорода.

Преимущество своего подхода исследователи продемонстрировали на рецепторе EGFR. Они обнаружили, что этот рецептор почти не экспрессируется в 2D-культуре по сравнению с 3D-культурой. Это различие не было связано с интернализацией белка — в эндоцитоме 2D-модели было меньше рецептора, чем в эндоцитоме 3D-модели. Авторы подчеркивают необходимость учитывать пространственную организацию опухолевой ткани при скрининге препаратов.

Ученые также показали, что белки EGFR и TF, которые сейчас рассматриваются в клинических исследованиях как потенциальные мишени для терапии опухолей, часто присутствуют в эндосомах. Это означает, что они могут находиться как на поверхности клетки, так и внутри нее.

TS-MAP также позволяет анализировать интактные образцы опухоли от пациента, а также иммуные клетки опухоли и периферической крови.

По мнению авторов, метод TS-MAP вместе с классификатором SURFME позволит исследовать сурфасеом разнообразных солидных опухолей для подбора мишеней персонализированной иммунотерапии.