Нуклеаза — предок Cas9 может стать новым инструментом редактирования генома

Считается, что нуклеаза Cas9, входящая в состав систем CRISPR-Cas9, произошла от белков группы IscB — нуклеаз, кодируемых транспозонами широко распространенного семейства IS200/605. Однако свойства нуклеаз IscB несколько лет оставались неизвестными. В новой статье, опубликованной в Science, американские ученые под руководством Евгения Кунина (Национальный центр биотехнологической информации, Бетесда) и Фэна Чжана (Институт Бродов, МТИ, Гарвард) охарактеризовали белки IscB, а также описали белки семейства TnpB — нуклеазы, также кодируемые транспозонами IS200/605; от них, вероятно, произошел белок Cas12.

Белок IscB по доменной архитектуре схож с Cas9: он имеет два эндонуклеазных домена, RuvC и HNH, причем домен RuvC разделен на две части альфа-спиралью. Cas9 и IscB — единственные белки, содержащие оба домена. С помощью филогенетического анализа авторы работы подтвердили, что все современные белки Cas9 произошли от одного белка IscB.Также они показали, что часть белков IscB ассоциирована с локусом CRISPR.

Биохимические исследования и РНК-секвенирование позволили установить, что ассоциированные с CRISPR белки IscB взаимодействуют с некой некодирующей РНК, которая транскрибируется частично с CRISPR и частично с межгенного участка, разделяющего CRISPR и ген IscB. Оказалось, что IscB функционирует как РНК-направляемая нуклеаза: некодирующая РНК привлекает белок к мишени — участку двухцепочечной ДНК, в которую IscB вносит разрыв.

Чтобы проверить гипотезу о возможной эволюции системы IscB в CRISPR, авторы провели поиск консервативных последовательностей вблизи открытой рамки считывания гена iscB. Действительно, был обнаружен высококонсервативный участок длиной около 300 п.н. перед геном, который кодирует РНК с функционально значимыми шпильками; авторы предложили обозначить ее как ωРНК. Структурное сходство ωРНК с некодирующей РНК из локуса, ассоциированного с CRISPR, указывало на то, что и она функционирует как направляющая РНК IscB.

Далее ученые показали, что IscB может быть перепрограммирована на разрезание разных мишеней с помощью различных направляющих РНК. Однако для успешного распознавания рядом с последовательностью-мишенью должен находиться специальный мотив, названный учеными TAM (target adjacent motif). Авторы работы отмечают, что программирование IscB на распознавание различных мишеней делает возможным их широкое применение для редактирования геномов, в том числе и геномов клеток человека. Последнее было подтверждено экспериментами с клетками линии HEK293: IscB успешно вносили вставки и делеции в их геномы. Важное преимущество IscB — небольшой по сравнению с Cas9 размер, облегчающий доставку в клетки.

Построение филогенетического дерева по множественным выравниваниям домена RuvC и спирали между его двумя частями позволило восстановить эволюционный путь систем CRISPR-Cas9. Ученые показали, что белки Cas9 вместе с IscB и нуклеазами группы IsrB формируют отдельную кладу, причем Cas9 в дальнейшем разделяются на две подгруппы. Локусы CRISPR возникали в системах IscB несколько раз независимо, и от одного кластера IscB, ассоциированного с CRISPR, в ходе эволюции и произошли белки Cas9.

Транспозоны IS200/605 кодируют и другие РНК-направляемые нуклеазы, помимо IscB. В частности, нуклеазы семейства TnpB, которые считаются предками белков Cas12, тоже связывают некодирующие РНК, которые могут выступать в роли направляющих. (См. рисунок в пресс-релизе Института Макговерна, МТИ.) Семейство нуклеаз, кодируемых транспозонами, в которое входят IscB, IsrB и TnpB, назвали OMEGA (Obligate Mobile Element Guided Activity). Смысл названия в том, что идентичность направляющих последовательностей, вероятно, определяется локализацией мобильных элементов. Каждый раз, когда транспозоны перемещаются, они создают новую направляющую РНК и тем самым новую мишень. Хотя биологические функции омега-систем пока непонятны, можно предположить, например, что они не позволяют клетке избавиться от транспозона по принципу «токсин-антитоксин».

Широкое распространение омега-систем говорит о том, что механизмы РНК-направляемого редактирования чаще встречаются у прокариот, чем предполагалось, и что они возникали в ходе эволюции неоднократно и независимо. Найдены миллионы возможных локусов tnpB в геномах бактерий и архей. Более того, локус iscB присутствует в геноме хлоропластов. Не исключено, что «экспансия РНК-направляемых систем в эукариотические геномы является распространенным явлением, и, более широко, эти РНК-направляемые системы функционально разнообразны и проникают во всех домены жизни», пишут авторы в заключение.