Обнаружен механизм высвобождения аларминов из нейтрофилов на ранних этапах иммунного ответа

Многие распространенные заболевания связаны с развитием воспалительных процессов. Поэтому более глубокое понимание механизмов воспаления — важный шаг на пути к разработке новых терапевтических подходов. Нейтрофилы необходимы для возникновения и поддержания воспалительных процессов в крови и тканях. Уже в процессе активации нейтрофилы начинают секретировать в кровь провоспалительные цитокины. Группа исследователей из Германии и Швейцарии обнаружила молекулярные механизмы, с помощью которых нейтрофилы выделяют сигнальные молекулы алармины на раннем этапе иммунного ответа.

Активация нейтрофилов приводит к секреции молекул, связанных с повреждением (damage-associated molecular pattern molecules, DAMP). S100A8/S100A9 — одна из таких молекул. Ее также называют кальпротектин, или MRP8/MRP14, и она способна модулировать иммунные реакции после высвобождения из иммунных клеток. В нейтрофилах человека S100A8/S100A9 составляет около 40% от всех белков цитозоля, что делает эти клетки основным источником данного алармина. Пассивный выброс S100A8/S100A9 во внеклеточное пространство происходит при повреждении тканей и при нетозе — программируемой клеточной гибели нейтрофилов. Активная секреция вызывается клеточным стрессом.

У S100A8/S100A9 нет сигнального пептида, необходимого для активации системы секреции. В новой работе авторы показали, что запуск секреции S100A8/S100A9 нейтрофилами зависит от E-селектина. Для начала авторы исследовали зависимость высвобождения S100A8/S100A9 от формирующего поры белка газдермина D (GSDMD) и активирующей его каспазы 1. Для этого они вводили TNF в мошонку мышей дикого типа и мышей C57BL/6 с нокаутом GSDMD (Gsdmd-/-) или каспазы 1 и каспазы 11 (Casp1-/-Casp11-/-). Уровень S100A8/S100A9 в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа до и через два часа после обработки TNF. TNF значительно повышал уровень S100A8/S100A9 в сыворотке крови мышей дикого типа. Этот эффект отсутствовал у Gsdmd-/- и Casp1-/-Casp11-/- животных. У мышей с дефицитом Е-селектина (Sele-/-) также не наблюдалось повышения уровня S100A8/S100A9 после стимуляции TNF.

Далее авторы стимулировали нейтрофилы костного мозга, выделенные у мышей дикого типа, а также у Gsdmd-/- и Casp1-/-Casp11-/- мышей, E-селектином или фосфатным буфером в качестве контроля в течение 10 мин и определяли количество секретируемого S100A8/S100A9. Стимуляция E-селектином вызывала быстрое высвобождение S100A8/S100A9 в клетках мышей дикого типа, тогда как отсутствие каспазы 1 и каспазы 11 или GSDMD препятствовало его высвобождению.

Чтобы выяснить, вызывает ли стимуляция Е-селектином активацию инфламмасомы и последующее расщепление каспазы 1 в нейтрофилах, исследователи стимулировали нейтрофилы человека Е-селектином или фосфатным буфером в качестве контроля и проводили вестерн-блоттинг. Чтобы исключить возможность того, что высвобожденный S100A8/S100A9 индуцирует TLR4-опосредованную активацию инфламмасомы, эксперименты проводили в присутствии ингибитора TLR4 TAC242 и пахинимода — ингибитора взаимодействия S100A8/S100A9-TLR4. В результате через 10 минут инкубации нейтрофилов с E-селектином в супернатанте наблюдалась активированная (разрезанная) каспаза 1. Результат не зависел от присутствия TAC242 и пахинимода, что свидетельствует о том, что активация каспазы 1 опосредована Е-селектином, а не TLR4-сигналингом. Кроме того, присутствие специфического ингибитора NLRP3-инфламмасомы MCC950 предотвращало E-селектин-индуцированную активацию каспазы 1, что указывает на участие инфламмасомы NLRP3 в этом процессе.

При активации NLRP3-инфламмасомы полноразмерный GSDMD расщепляется до N-концевого GSDMD (GSDMD-NT), который олигомеризуется на плазматической мембране клетки и образует поры. Чтобы проверить, будет ли стимуляция нейтрофилов Е-селектином также опосредовать расщепление GSDMD, авторы стимулировали нейтрофилы в течение 10 мин Е-селектином и определяли количество полноразмерного GSDMD и расщепленного N-концевого GSDMD. Одновременная инкубация клеток с E-селектином и MCC950 предотвращала расщепление GSDMD. Конфокальная микроскопия с использованием антитела, которое специфически распознает GSDMD-NT, показала индуцированное Е-селектином расщепление и транслокацию GSDMD на поверхность клетки. Расщепление GSDMD и транслокация на поверхность GSDMD-NT отсутствовали как в нестимулированных нейтрофилах, так и в нейтрофилах, стимулированных Е-селектином, предварительно обработанных MCC950. Полученные данные свидетельствуют о том, что Е-селектин опосредует образование поры в нейтрофилах NLRP3-зависимым образом, что приводит к высвобождению S100A8/S100A9.

В данной работе исследователи обнаружили Е-селектин-зависимую систему активации нейтрофилов, которая запускает сборку инфламмасомы NLRP3, что приводит к образованию пор GSDMD и высвобождению S100A8/S100A9 из нейтрофилов. Воздействие на этот сигнальный путь активации нейтрофилов может стать потенциальным терапевтическим подходом для лечения различных воспалительных заболеваний.

Нейтрофилы пожирают апоптотические клетки изнутри